激光共聚焦顯微鏡技術(shù)

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1、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)吉林大學(xué)人獸共患病研究所王心蕊緒論激光共聚焦顯微鏡技術(shù)（ConfocalLasersScanningMiccruscopeCLSM)CLSM是將顯微鏡技術(shù)與激光技術(shù)有效的結(jié)合，使用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，對(duì)有熒光標(biāo)記物的形態(tài)及功能，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行成像，從而得到細(xì)胞或內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。它匯集了激光技術(shù)，顯微鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)，計(jì)算機(jī)及圖像處理技術(shù)，精密的機(jī)械技術(shù)等高，精，尖細(xì)胞分析及工程技術(shù)于一體的新技術(shù)。激光共聚焦顯微鏡發(fā)展史在1957年MarvinMinsky提出共聚焦顯微鏡的理論，但共聚焦顯微鏡作為商品推出是在20世紀(jì)80年代初期，早期的激光共聚焦

2、顯微鏡在技術(shù)上很不完善，其應(yīng)用也受到限制。至到20世紀(jì)80年代末，光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)不斷改進(jìn)，成像的質(zhì)量和靈敏度都有所提高，進(jìn)入90年代初，激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中逐步引入混合激光和紫外激光技術(shù)。90年代末由美國(guó)Meridian公司推出的新型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，已具備完善的光學(xué)系統(tǒng)，模塊化的儀器設(shè)計(jì)，靈活的軟件和高配置的計(jì)算機(jī)硬件，從而使共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的功能不斷升級(jí)，應(yīng)用的領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。隨著生命科學(xué)研究的不斷深入及熒光探針技術(shù)的迅速發(fā)展，共聚焦顯微鏡將推動(dòng)生命科學(xué)研究的迅速發(fā)展，同時(shí)生命科學(xué)研究的進(jìn)展也將使激光顯微鏡技術(shù)不斷改進(jìn)和完善。激光共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡是現(xiàn)今最為先

3、進(jìn)的光學(xué)顯微鏡，其主要優(yōu)點(diǎn)為：以激光為光源，在相應(yīng)的熒光探針標(biāo)記后，對(duì)樣本進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，逐層獲得二維光學(xué)橫斷面圖像，具有“細(xì)胞CT”的功能，并可通過(guò)計(jì)算機(jī)三維重建軟件支持，獲得真三維圖像，并可以任意角度旋轉(zhuǎn)，觀察細(xì)胞，組織的立體形態(tài)和空間關(guān)系；可以對(duì)活細(xì)胞和組織進(jìn)行無(wú)損傷的觀察，動(dòng)態(tài)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的Ca離子濃度和pH值等活細(xì)胞生理信息；可對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，細(xì)胞間通訊，細(xì)胞融合，細(xì)胞骨架彈性測(cè)量等，可用作“光刀子”完成細(xì)胞內(nèi)“外科手術(shù)”。這一技術(shù)使得對(duì)活細(xì)胞和組織進(jìn)行原位，動(dòng)態(tài)，定量的觀察和測(cè)量的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)。光學(xué)顯微鏡顯微鏡的基本原理普通顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理

4、激光共聚焦顯微鏡基本結(jié)構(gòu)和原理顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光學(xué)系統(tǒng)機(jī)械裝置顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光學(xué)系統(tǒng)（1）目鏡有一組透鏡組成目鏡，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場(chǎng)大小目鏡可分為：普通目鏡；廣角目鏡兩種（2）物鏡它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有10X、20X、40X、60X、100X等（3）光源有鹵素?zé)簟㈡u絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。（4）聚光器　包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過(guò)來(lái)的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位。孔徑光闌可控制聚光器的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度

5、。顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（1）機(jī)架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。（2）目鏡筒　位于機(jī)架上方，靠圓形燕尾槽與機(jī)架固定目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈?zhǔn)胶推揭剖健?（3）物鏡轉(zhuǎn)換器　它是一個(gè)旋轉(zhuǎn)圓盤，上有3～5個(gè)孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進(jìn)入工作光路。（4）載物臺(tái)　是放置玻片的平臺(tái)，其中央具有通光孔。臺(tái)上有一個(gè)彈性的標(biāo)本夾，用來(lái)夾住載玻片。右下方有移動(dòng)手柄，使載物臺(tái)面可在XY雙方向進(jìn)行移動(dòng)。（5）調(diào)焦機(jī)構(gòu)　利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)，使載物臺(tái)作粗調(diào)和微調(diào)的升降運(yùn)動(dòng)，從而使被觀察物體

6、對(duì)焦清晰成像。（6）聚光器調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)聚光器安裝在其上，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。光學(xué)顯微鏡的分類光學(xué)顯微鏡的分類光學(xué)顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺(jué)和非立體視覺(jué)顯微鏡；按觀察對(duì)像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對(duì)比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。明場(chǎng)觀察微分干涉襯DIC浮雕相襯RC相襯（相差）暗場(chǎng)觀察熒光觀察偏光觀察熒光

7、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理熒光顯微鏡的構(gòu)成熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理光源激發(fā)濾片、雙色反色鏡、阻斷濾片物鏡、目鏡汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)熒光顯微鏡光源氙燈光源：高峰值更寬，更穩(wěn)定熒光激發(fā)塊鏡組A激發(fā)濾色鏡C吸收濾色鏡B分光鏡吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分光鏡BT%AC熒光顯微鏡的分類透射式：激發(fā)光來(lái)自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得