激光共聚焦顯微鏡.doc

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1、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)　　2.1ACASULTIMa312硬件及參數(shù)指標(biāo)激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999mW的可見光），能同時(shí)/順序/分別輸出紫外光和可見光，激發(fā)波長(zhǎng)為351-364nm；488nm；514nm。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盤/150MBBernoulli盤驅(qū)動(dòng)器/17’’大屏幕顯示器。共聚焦系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制光路準(zhǔn)調(diào)節(jié)；計(jì)算機(jī)控制孔徑校準(zhǔn)；計(jì)算機(jī)調(diào)節(jié)孔徑大?。蛔詣?dòng)Z軸調(diào)節(jié)（最小0.1μm）。光學(xué)探測(cè)系統(tǒng)：3個(gè)測(cè)窗式PMT采集熒光；1個(gè)CCD系統(tǒng)；12位的高速A/D轉(zhuǎn)換器。圖

2、像分辨率：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級(jí)。掃描方式：快速鏡掃描DualScan臺(tái)階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm；掃描平面：XY和XZ和獨(dú)特點(diǎn)、線、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統(tǒng)　　ACASULTIMa312系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的軟件將激光細(xì)胞儀與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能?；谏镝t(yī)學(xué)研究有如下的軟件?！　mageAnalyze―對(duì)于單色、比色和三色標(biāo)記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時(shí)AutoImage可多個(gè)區(qū)域的自動(dòng)

3、掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時(shí)間順序掃描。RatioAnalysis和Kinetics―測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的離子變化，可有點(diǎn)掃描、線掃描及圖像掃描三種測(cè)定形式，以監(jiān)測(cè)各種速率的生物反應(yīng)。Cell?CCellCommunicationandFRAP-相鄰細(xì)胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細(xì)胞熒光，然后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)掃描，此掃描可對(duì)單一區(qū)域或細(xì)胞的多個(gè)選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊。CellList―儲(chǔ)存被選擇細(xì)胞的位置，即可自動(dòng)對(duì)較大樣品進(jìn)行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡(luò)位置表，以進(jìn)行自動(dòng)的測(cè)量、篩選和重復(fù)測(cè)定。CellSorting―ACAS具備如下

4、四種分選方式：AblationSort:預(yù)選定義一個(gè)熒光閾值，然后對(duì)特定細(xì)胞殺傷。②CookieCutterSort在用戶定義的中心點(diǎn)四周切割Cookies。③QuickSort：對(duì)已定義的細(xì)胞表列，用Ablation或CookieCutter作分選。④ManualSort：直接使用鼠標(biāo)控制載物臺(tái)位置及激光脈沖，并殺滅和分選細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。ConfocalImaging―共聚焦分析，可實(shí)現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點(diǎn)移動(dòng)動(dòng)畫。　3激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用　

5、　3.1定量熒光測(cè)量　　ACAS可進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測(cè)及活細(xì)胞熒光定量分析。利用這一功能既可對(duì)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測(cè)定，還可測(cè)定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測(cè)定，這種定量可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息?！　?.2定量共聚焦圖像分析　　借助于ACAS激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募?xì)胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維

6、重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測(cè)定細(xì)胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴(kuò)散、胞內(nèi)離子等，亦可以對(duì)這些動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)及定位分析?！　?.3三維重組分析生物結(jié)構(gòu)　　ACAS使用SFP進(jìn)行三維圖像重組，SFP將各光學(xué)切片的數(shù)據(jù)組合成一個(gè)真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動(dòng)逼真的三維效果?！　?.4動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定　　Ca2+、pH及其它細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定，利用ACAS能迅速對(duì)樣品的點(diǎn)，線或二維圖像掃描，測(cè)量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo-1、BCECF、F

7、luo-3等多種熒光探針對(duì)各種離子作定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U(kuò)散速率，能定量測(cè)定細(xì)胞溶液中Ca2+對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子及各種激素等刺激的反應(yīng)，以及使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進(jìn)行Ca2+和pH的同時(shí)測(cè)定?！　?.5熒光光漂白恢復(fù)（FRAP）--活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)　　熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，可通過低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)此擴(kuò)散速率。通過ACAS可直接測(cè)量分子擴(kuò)散率、恢復(fù)速度，并由此而揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相