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《trizol法提取rna實(shí)驗(yàn)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、Trizol法使用步驟一、分離純化的基本原理研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù)，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。二、用戶(hù)需自備的試劑和材料無(wú)水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準(zhǔn)備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的
2、物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必須戴手套。1、料制品的處理盡可能使用無(wú)菌，一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)通常沒(méi)有必要再
3、次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下：1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。2）處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通風(fēng)柜中室溫處理過(guò)夜。4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。2、璃玻和金屬物品250°C烘烤3
4、小時(shí)以上。四、從組織中提取總RNA1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行第2步操作。2)勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，組織體積不能超過(guò)Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。五、從細(xì)胞中提取總RNA1)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比
5、例加入。2)懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。六、操作步驟1、細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長(zhǎng)期保持。2、12,000rpm離心5min，棄沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。4、4℃12,000g離心15min。5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬(wàn)不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚
6、相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。6、按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。7、4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。9、4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。10、室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.
7、5%SDS均須用DEPC處理并高壓。12、測(cè)O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之間；產(chǎn)率估計(jì)：組織標(biāo)本：（ugRNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細(xì)胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：組織或細(xì)胞量過(guò)少，可酌情減少Trizol用量；組織或細(xì)胞用量過(guò)多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類(lèi)組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12,000g離心10min去掉不溶物，再進(jìn)行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉；熱天提RNA，帶手套
8、是必須的，手是RNase的主要來(lái)源；組織塊用液氮研磨，效果最好，若沒(méi)有液氮或電動(dòng)勻漿器，可用手動(dòng)勻漿器代替，此時(shí)組織塊不宜過(guò)大，且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎，然后再充分研磨。6.1.2.1肝臟、腸道、肌肉總RNA提取方法①使用已高溫蒸汽滅菌的手術(shù)刀和鑷子從魚(yú)的腹部解剖開(kāi)，從中取出完整的肝臟、腸、肌肉等組織，置于離心管后立即放入液氮中；②組織在
