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《trizol法提取RNA》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、植物總RNA的提取抽提RNA所用的研缽酒精灼燒5-10min.，其他器皿均用0.1%的DEPC水處理，24hr.后高溫高壓滅菌兩次，以去除RNA酶，所有試劑都保證沒有RNA酶污染。1)1.5ml離心管中加入1mlTrizol，取0.1g組織在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混勻。2)將混勻的組織在15-30℃放10min，使核酸蛋白復(fù)合體物完全分離。3)4℃，10000rpm離心20min，取上清。4)加氯仿200μl，5MNaCl200μl，劇烈振蕩15s，室溫放置3min（或
2、不放置，直接離心）。5)4℃，10000rpm離心20min，樣品會分成3層，取上層水相，取上清。176)加500μl異丙醇，混勻，室溫放置10min。7)4℃，10000rpm離心15min，去上清，管底管側(cè)形成膠狀沉淀。8)加1ml75%乙醇，洗滌沉淀，重復(fù)兩次，洗滌用4℃，7500rpm離心5min，棄上清。9)吹干約15min。10)加50μlDEPC處理的水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。DNaseI處理消化植物總RNA中的基因組DNA1)取5μl的植物總RNA，然后順序加
3、入1μl10×緩沖液，1μlDNase，3μlRNase-free水，總體積10μl，充分混勻后，37℃溫育30min。2)加入1μl終止緩沖液，65℃溫育10min，使DNase失活。反轉(zhuǎn)錄cDNA1)在上述總體積為11μl反應(yīng)液中加入1μlOligo(dT)18引物4μl5×緩沖液，2μldNTP，1μl反轉(zhuǎn)錄酶，1μlRNase抑制劑，總體積20μl，充分混勻后，42℃溫育1-1.5hr。2)70℃溫育10min，終止反應(yīng)trizol法提取RNA步驟2010年03月09日星期二17:07從
4、組織中提取總RNA1)液氮研磨，組織塊直接放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管進(jìn)行第2步操作。2)勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol，另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。從細(xì)胞中提取總RNA1)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/m
5、l比例加入。2)懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動物、植物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。2．細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時可放入-70℃長期保持。3．12000rpm離心5min，棄沉淀。4．按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。5．4℃12000g離心15min。6．吸取上層水相，至另一離心管中。注：1）千萬不要吸取中間界面。2)若同時提取D
6、NA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。7．按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。8．4℃12000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。9．按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。10．4℃8000g離心5min，盡量棄上清。11．室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。12．可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-
7、60℃5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。12、測O.D值定量DNA濃度。注：1）此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之間。2)產(chǎn)率估計：組織標(biāo)本：（ugRNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細(xì)胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：1、組織或細(xì)胞量過少，可酌情減少Trizol用量。2、組織或細(xì)胞用量過多，會引起DNA對RNA的污染。3、高蛋白，脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃1200離心10m
8、in去掉不溶物，再進(jìn)行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉。4、熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來源。5、組織塊用液氮研磨，效果最好，若沒有液氮或電動勻漿器，可用手動勻漿器代替，此時組織塊不宜過大，且需先用眼科剪將組織絞碎，然后再充分研磨。植物總RNA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+
