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《trizol法提取rna實驗步驟及原理(新手詳細注釋版)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、Trizol法使用步驟一、分離純化的基本原理研究基因的表達和調(diào)控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學(xué)實驗的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。二、用戶需自備的試劑和材料無水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復(fù)性。用
2、常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一種RNase抑制劑)配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達到要求。取RNase-free的物品時必須戴手套。1、料制品的處理盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已標明RNase-Free的塑料制品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下：1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加
3、入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強，小心在通風(fēng)柜中使用。2）處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通風(fēng)柜中室溫處理過夜。4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。2、璃玻和金屬物品250°C烘烤3小時以上。四、從組織中提取總RNA1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/ml
4、Trizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進行第2步操作。（液氮既能使各種組織成分不易被破壞或降解,又能使組織變硬,脆性增加易于磨碎。終止細胞內(nèi)外一切生物反應(yīng)，防止RNA酶的降解反應(yīng)）2)勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。五、從細胞中提取總RNA1)培養(yǎng)貼壁細胞：不須消化，可直接用Trizol進行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。2)懸浮細胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動物、植物或酵母細胞，或107細菌
5、細胞。六、操作步驟1、細胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時可放入-70℃長期保持。2、12,000rpm離心5min，棄沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿為有機溶劑，有效的使有機相和無機相迅速分離。有機相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進入水相）4、4℃12,000g離心15min。5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。6、按0.5
6、ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇（沉淀RNA）混勻，室溫放置5-10min。7、4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇（沉淀RNA），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。9、4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。10、室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。（TE緩沖液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，
7、能穩(wěn)定儲存DNA和RNA。用于酶切反應(yīng)不能使用SDS）12、測O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之間；產(chǎn)率估計：組織標本：（ugRNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：組織或細胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細胞用量過多，會引起DNA對RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12,000g離心10m
