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《Trizol法提取RNA實驗步驟.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、Trizol法使用步驟一、分離純化的基本原理研究基因的表達和調控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學實驗的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。二、用戶需自備的試劑和材料無水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導致RNA降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時
2、失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關的分子生物學實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，基本達到要求。取RNase-free的物品時必須戴手套。1、料制品的處理盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已標明RNase-Free的塑料制品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對于國產塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下
3、：1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中使用。2）處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通風柜中室溫處理過夜。4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。2、璃玻和金屬物品250°C烘烤3小時以上。四、從組織中提取總RNA1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待
4、組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉入離心管進行第2步操作。2)勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。五、從細胞中提取總RNA1)培養(yǎng)貼壁細胞：不須消化，可直接用Trizol進行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。2)懸浮細胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動物、植物或酵母細胞，或107細菌細胞。六、操作步驟1
5、、細胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時可放入-70℃長期保持。2、12,000rpm離心5min，棄沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。4、4℃12,000g離心15min。5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。6、按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。7、4℃12,000g離心10min
6、，棄上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。9、4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。10、室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。12、測O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之間；產率估計：組織標本：（ugRNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)
7、細胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：組織或細胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細胞用量過多，會引起DNA對RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12,000g離心10min去掉不溶物，再進行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉；熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來源；組織塊用液氮研磨，效果最好，若沒有液氮或電動勻漿器，可用手動勻漿器代替，此時組織塊不宜過大，且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎，然后再充分研磨。
