TRIzol法同時提取RNA,DNA,蛋白質(zhì).doc

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1、TRIzol法同時提取RNA,DNA,蛋白質(zhì)TRIzol法同時提取RNA,DNA,蛋白質(zhì)TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點(diǎn)是可同時分離一個樣品的RNADNA蛋白質(zhì)．TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)

2、。TRIzol試劑可用于小量樣品（50-100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對人，動物，植物組織，細(xì)菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于NorthernBlot，dotblot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)

3、可用于WesternBlotting。規(guī)格：100ml黃色透明液體儲存條件：2-8℃避光保存12個月注意：請勿直接接觸皮膚或吞咽，以免灼傷。如接觸皮膚應(yīng)立即用洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗，乙醇會加重灼傷程度。預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)：1.經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，

4、然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。4.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)操作步驟:1.勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1mlTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)

5、胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2

6、-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。6.2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。7.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzo

7、l加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。8.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA

8、也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。注意事項(xiàng)：1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加