余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響

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1、余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響作者：崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，林元藻【摘要】目的探討余甘子對小鼠免疫功能的影響。方法用不同劑量余甘子提取物給正常小鼠連續(xù)灌胃,檢測血清溶血素含量、腹腔巨噬細胞吞噬功能、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、T淋巴細胞增殖和NK細胞活性。結(jié)果余甘子提取物能增加小鼠血清溶血素含量、明顯增強小鼠巨噬細胞吞噬功能、改善遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，促進T淋巴細胞增殖，提高NK細胞活性。結(jié)論余甘子能顯著增強小鼠免疫功能?！娟P(guān)鍵詞】余甘子;免疫功能;溶血素;T淋巴細胞;巨噬細胞;NK細胞;遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)　余甘子PhyllanthusemblicaL.又名山油柑

2、、油甘子、余甘果等，為大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實，廣泛分布在廣東、福建、臺灣、貴州、湖南、廣西、四川、浙江和云南等省區(qū)。余甘子果入藥，中醫(yī)學(xué)認為，余甘子性味甘、酸、澀、涼,歸肺、胃經(jīng)。其功能與主治為清熱涼血，消炎,消食健胃,生津止咳;用于血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛及口干[1]。明《本草綱目》曾記載：“余甘子果，主補益氣，久服輕身，延年益壽”8。余甘子的藥理作用的研究報道很少，為了探討余甘子的抗腫瘤作用，本實驗研究了余甘子提取物對小鼠免疫功能影響，旨在了解余甘子的免疫藥理作用機制，為研究其抗腫瘤機制提供研究資料，為余甘子的食用和

3、藥用價值的開發(fā)提供實驗依據(jù)?！　?材料　　1.1材料、藥品與試劑余甘子采購自四川鹽源縣。經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院藥用植物與中藥鑒定學(xué)教研室李書淵教授鑒定為戟科葉下珠屬植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實。余甘子提取物制備：將余甘子晾干，取適量余甘子，常規(guī)水煎2次，過濾后混合并濃縮成1g生藥/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?，4二硝基氟苯(DNFB)，二甲基亞砜(DMSO)，上海試劑一廠產(chǎn)品。RPMI-1640，MTT，PHA，Sigma產(chǎn)品。721型分光光度計，CO2培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，離心機?！　?.2動物昆明種清潔級小鼠，雌雄兼用，體

4、質(zhì)量為(20±2)g，由廣州市白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場提供?！　?方法　　2.1余甘子提取物對小鼠體液免疫功能的影響采用溶血素測定法[2]：小鼠40只,體質(zhì)量(20±2)g，隨機分為4組，每組10只。空白對照組，每天灌胃蒸餾水0.5ml/只;試藥大劑量組、中劑量組、小劑量組，每只每天分別灌胃余甘子提取物45,30,15mg/kg，連續(xù)128d。給藥第2天，每只小鼠腹腔注射5%綿羊紅細胞懸液0.2ml免疫，末次給藥后禁食24h，斷頭取血并分離血清，將血清用生理鹽水按1∶50稀釋，取血清1ml，加5%綿羊紅細胞懸液0.5ml和補體1ml，37℃水浴

5、10min，冰浴，離心,取上清液1ml，測定A540，計算樣品的半數(shù)溶血值(HC50)。用HC50代表血清溶血素水平?！　?.2余甘子提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響[3]　　小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。第12天小鼠稱重，后腹腔注射5%淀粉肉湯1ml，致敏24h后，腹腔注射1ml5%雞紅細胞懸液，4h后脫臼處死，腹腔注入5ml冷Hanks液，按摩腹部5min后，解剖，無菌吸取腹腔液涂片，晾干，甲醇固定5min，瑞-姬氏復(fù)合染色劑染色，鏡檢，在油鏡下觀察，隨機計數(shù)100個吞噬細胞中吞噬雞紅細胞及吞噬的雞紅細胞總數(shù)，并

6、計算巨噬細胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)?！　?.3余甘子提取物對小鼠T淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響T淋巴細胞增殖反應(yīng)測定(MTT法)[4]：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。12d后脫頸處死，無菌取脾，制細胞懸液(5×106/ml)，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，再加入含PHA(10μg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液100μl，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育27h，后每孔加入MTT(5mg/μl)10μl，振蕩18min，放入37℃CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)3h，取出離心，棄上清，每孔加DMSO200μl，混勻，振蕩5min，

7、酶標(biāo)儀測A500。結(jié)果以3個復(fù)孔的±s表示?！　?.4余甘子提取物對特異性細胞免疫功能的影響DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的測定[2，5]：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。給藥后第6天進行致敏，在小鼠后肢皮下注射0.02ml1%DNFB，給藥第10天同法第2次致敏，于第1次致敏的第9天，用1%DNFB0.02ml涂于右耳進行攻擊，左耳涂布生理鹽水作為對照。次日處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下耳片，稱重。以耳腫脹度(EPR左右耳片重量之差)作為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的指標(biāo)?！　?.5余甘子提取物

8、對非特異性細胞免疫功能的影響NK細胞活性測定[2]：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。12d后，處死取脾，制成細胞懸液，按乳酸脫氫酶