人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究

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1、人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究作者：王中興，鹿均先，熊傳芝【摘要】目的：觀察人脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）體外分離培養(yǎng)及成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化的生物學(xué)性狀，探討其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。方法：（1）人脂肪組織來源于健康成年女性腹部吸脂術(shù)，酶消化法分離出ADSCs,體外培養(yǎng)擴(kuò)增。（2）取第3代ADSCs,測細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞儀測原代細(xì)胞表面標(biāo)記；成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化。（3）倒置顯微鏡觀察油紅O、阿爾辛藍(lán)（ABPSA）染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測分化情況；RTPCR檢

2、測相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)。結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞形態(tài)均一,傳代穩(wěn)定。（2）經(jīng)成脂誘導(dǎo),細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,油紅O染色呈紅色,RTPCR檢測到有Leptin、PPARγ表達(dá)；經(jīng)成軟骨誘導(dǎo),ABPSA染色呈紫紅色,Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞漿呈棕黃色,RTPCR檢測COLLⅡ、SOX9和aggrecan表達(dá)。結(jié)論:脂肪干細(xì)胞能向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化,可作為軟骨組織工程種子細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】脂肪基質(zhì)干細(xì)胞;分化;軟骨;組織工程8近年來組織工程學(xué)發(fā)展迅速，為骨科治療頑疾帶來了新的希望，但是如何獲得大量的

3、種子細(xì)胞卻一直制約其發(fā)展，通常骨組織工程所用的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMCs）由于難以分離和培養(yǎng)，限制了其成為良好的組織工程種子細(xì)胞來源。本實(shí)驗(yàn)通過對成人皮下脂肪組織來源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及向軟骨定向誘導(dǎo)，以期建立獲取脂肪來源干細(xì)胞和誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化的方法，為組織工程軟骨的構(gòu)建提供新的種子細(xì)胞。1材料和方法1.1材料本實(shí)驗(yàn)所用脂肪組織來自于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院整形外科腹部吸脂者，均為女性，年齡20～45歲。Ⅰ型膠原酶為美國Worthington公司產(chǎn)品，DMEM粉劑為GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清

4、(FBS)為HYCLONE公司產(chǎn)品，兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體及免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。1.2方法1.2.1脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（adiposederivedstem8cells，ADSCs）的分離培養(yǎng)無菌條件下取脂肪組織，0.075%Ⅰ型膠原蛋白酶消化（放入37℃震顫水浴槽中60min），1200×g離心10min，去除漂浮的脂肪細(xì)胞及上清液，DMEM培養(yǎng)液（含10％胎牛血清、100μg·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素）重懸細(xì)胞，接種至培

5、養(yǎng)皿中，以3×104個(gè)有核細(xì)胞·cm-2密度接種，在37℃、5%CO2、飽和濕度為100％的培養(yǎng)箱中孵育，48h后首次換液，棄去未貼壁細(xì)胞。細(xì)胞生長至75％～90％融合時(shí)傳代，每2～3d更換培養(yǎng)液。1.2.2MTT法測生長曲線取第3代細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107L-1,接種于24孔板,每孔接種1ml,分8組,每組3孔,共24孔。每天計(jì)數(shù)1組，取3個(gè)孔的均值。繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。1.2.3向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)（1）取第3代細(xì)胞,以4.0×107L-1密度接種于預(yù)先放置

6、了小玻片的24孔板,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞爬滿玻片后用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol·L-1IBMX、1μmol·L-1地塞米松,10μmol·L-1胰島素、1%青鏈霉素原液)誘導(dǎo)分化2周，每72h換液1次，相差顯微鏡觀察。（2）成脂特性檢測：取成脂誘導(dǎo)2周后的玻片，10%甲醛溶液固定10min后水洗，于60%異丙醇溶液內(nèi)侵洗。油紅O染液染色10～15min，雙蒸水內(nèi)洗,甘油明膠封固，顯微鏡下觀察，RTPCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)情況。81.2.

7、4向成軟骨誘導(dǎo)（1）取接種于25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞,用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM、1%胎牛血清、10μg·L-1TGFβ1、50nmol·L-1抗壞血酸、6.25mg·L-1胰島素、1%青鏈霉素原液)誘導(dǎo)分化2周,相差顯微鏡觀察。（2）成軟骨特性檢測。阿爾辛藍(lán)（ABPSA）染色：4%多聚甲醛固定細(xì)胞，AlcianBlue染液(AlcianBlue1.0g、蒸餾水97ml、冰醋酸3ml)孵育30min，蒸餾水洗,1%過碘酸水溶液氧化5～10min，Schiff試劑染20min,蘇木精染核

8、,甘油明膠封固。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：4%多聚甲醛固定細(xì)胞，蒸餾水洗,加0.2U·ml-1軟骨素酶ABC，37℃孵育30min,加3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用,蒸餾水洗,加5%BSA室溫作用20min,加1∶100稀釋的兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體,4℃孵育過夜。按試劑盒說明依次加入二抗、SABC和DAB顯色,蘇木精對比染色。RTPCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)情況。2結(jié)果2.1原代ADSCs形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞接種后24