人脂肪干細胞體外培養(yǎng)及向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究

《人脂肪干細胞體外培養(yǎng)及向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、人脂肪干細胞體外培養(yǎng)及向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究：王中興，鹿均先，熊傳芝【摘要】目的：觀察人脂肪基質(zhì)干細胞（ADSCs）體外分離培養(yǎng)及成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化的生物學(xué)性狀，探討其作為軟骨組織工程種子細胞的可行性。方法：（1）人脂肪組織于健康成年女性腹部吸脂術(shù)，酶消化法分離出ADSCs,體外培養(yǎng)擴增。（2）取第3代ADSCs,測細胞生長曲線,流式細胞儀測原代細胞表面標(biāo)記；成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化。（3）倒置顯微鏡觀察油紅O、阿爾辛藍（ABPSA）染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色檢測分化情況；RTPCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因表

2、達。結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的ADSCs細胞形態(tài)均一,傳代穩(wěn)定。（2）經(jīng)成脂誘導(dǎo),細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,油紅O染色呈紅色,RTPCR檢測到有Leptin、PPARγ表達；經(jīng)成軟骨誘導(dǎo),ABPSA染色呈紫紅色,Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色胞漿呈棕黃色,RTPCR檢測COLLⅡ、SOX9和aggrecan表達。結(jié)論:脂肪干細胞能向軟骨細胞方向誘導(dǎo)分化,可作為軟骨組織工程種子細胞?！娟P(guān)鍵詞】脂肪基質(zhì)干細胞;分化;軟骨;組織工程近年來組織工程學(xué)發(fā)展迅速，為骨科治療頑疾帶來了新的希望，但是如何獲得大量的種子細胞卻一直制約其發(fā)展，

3、通常骨組織工程所用的骨髓基質(zhì)干細胞（BMCs）由于難以分離和培養(yǎng)，限制了其成為良好的組織工程種子細胞。本實驗通過對成人皮下脂肪組織干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及向軟骨定向誘導(dǎo)，以期建立獲取脂肪干細胞和誘導(dǎo)其向軟骨細胞分化的方法，為組織工程軟骨的構(gòu)建提供新的種子細胞。1材料和方法1.1材料本實驗所用脂肪組織來自于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院整形外科腹部吸脂者，均為女性，年齡20～45歲。Ⅰ型膠原酶為美國EM粉劑為GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)為HYCLONE公司產(chǎn)品，兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體及免疫組化試劑盒購自北

4、京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。1.2方法1.2.1脂肪基質(zhì)干細胞（adiposederivedstemcells，ADSCs）的分離培養(yǎng)無菌條件下取脂肪組織，0.075%Ⅰ型膠原蛋白酶消化（放入37℃震顫水浴槽中60min），1200×g離心10min，去除漂浮的脂肪細胞及上清液，DMEM培養(yǎng)液（含10％胎牛血清、100μg·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素）重懸細胞，接種至培養(yǎng)皿中，以3×104個有核細胞·cm-2密度接種，在37℃、5%CO2、飽和濕度為100％的

5、培養(yǎng)箱中孵育，48h后首次換液，棄去未貼壁細胞。細胞生長至75％～90％融合時傳代，每2～3d更換培養(yǎng)液。1.2.2MTT法測生長曲線取第3代細胞消化制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞懸液濃度為1×107L-1,接種于24孔板,每孔接種1ml,分8組,每組3孔,共24孔。每天計數(shù)1組，取3個孔的均值。繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間。1.2.3向脂肪細胞誘導(dǎo)（1）取第3代細胞,以4.0×107L-1密度接種于預(yù)先放置了小玻片的24孔板,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞爬滿玻片后用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(

6、高糖DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol·L-1IBMX、1μmol·L-1地塞米松,10μmol·L-1胰島素、1%青鏈霉素原液)誘導(dǎo)分化2周，每72h換液1次，相差顯微鏡觀察。（2）成脂特性檢測：取成脂誘導(dǎo)2周后的玻片，10%甲醛溶液固定10min后水洗，于60%異丙醇溶液內(nèi)侵洗。油紅O染液染色10～15min，雙蒸水內(nèi)洗,甘油明膠封固，顯微鏡下觀察，RTPCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因表達情況。1.2.4向成軟骨誘導(dǎo)（1）取接種于25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至第3代的細胞,用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM、1%胎牛血清

7、、10μg·L-1TGFβ1、50nmol·L-1抗壞血酸、6.25mg·L-1胰島素、1%青鏈霉素原液)誘導(dǎo)分化2周,相差顯微鏡觀察。（2）成軟骨特性檢測。阿爾辛藍（ABPSA）染色：4%多聚甲醛固定細胞，AlcianBlue染液(AlcianBlue1.0g、蒸餾水97ml、冰醋酸3ml)孵育30min，蒸餾水洗,1%過碘酸水溶液氧化5～10min，Schiff試劑染20min,蘇木精染核,甘油明膠封固。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：4%多聚甲醛固定細胞，蒸餾水洗,加0.2U·ml-1軟骨素酶ABC，37℃孵

8、育30min,加3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用,蒸餾水洗,加5%BSA室溫作用20min,加1∶100稀釋的兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體,4℃孵育過夜。按試劑盒說明依次加入二抗、SABC和DAB顯色,蘇木精對比染色。RTPCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因表達情況。2結(jié)果2.1原代ADSCs形態(tài)學(xué)觀察細胞接種后24h開始貼壁，初為小圓形，直徑5μm，色深。48h后大部分細胞已