膠體金免疫試驗探析

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1、膠體金免疫試驗探析膠體金免疫試驗探析膠體金免疫試驗探析膠體金免疫試驗探析膠體金免疫試驗探析　　一、膠體金免疫結(jié)合試驗的檢測原理　　膠體金免疫結(jié)合試驗的檢測原理是以微孔濾膜為載體,包被已知抗原或抗體,加入待檢標本后,經(jīng)濾膜的毛細管作用使標本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合,再通過膠體金結(jié)合物達到檢測目的。根據(jù)檢測裝置的不同可分為金免疫滲濾試驗(GIFA)和金免疫層析試驗(GICA)?！　?·GIFA:GIFA始于1985年[1],最初以酶作為標記物。1989年發(fā)展了以膠體金為標記物用于檢測艾滋病病毒抗體的滲濾試驗[2],確立了GIFA的基本技術(shù)。GI

2、FA試劑盒有2個主要成分:一是金標抗體結(jié)合物,另一是滲濾裝置。該裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒,在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜,膜上預(yù)包被抗原或抗體斑點。試驗時將標本滴加在膜上,通過滲濾使抗原抗體在膜上發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng);再滴加金標結(jié)合物,使其與對應(yīng)抗體抗原結(jié)合并顯色。陽性結(jié)果在膜上出現(xiàn)著色斑點?！　IFA檢測操作步驟與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法相同。差別在于加樣、反應(yīng)和洗滌均通過滲濾完成。檢測全過程僅需數(shù)分鐘,但敏感度卻與需數(shù)小時完成的ELISA相仿。其原因在于:ELISA樣品中的待檢抗原需緩慢地擴散才能與吸附于固相表面的抗體反應(yīng),而在

3、膜滲濾法中,抗體充滿了膜的微孔,待檢液體層層滲濾時抗原抗體緊密接觸形成免疫濃縮,從而提高了反應(yīng)效率。另外,以膠體金作為標記物,不但減少了操作步驟,而且試劑可在室溫長期保存?！　?·GICA:1990年Oskiowicz等[3]應(yīng)用硒作為標記物建立了免疫層析試驗。其后一般均采用簡便的膠體金試驗。其檢測原理與GIFA相同,不同點在于液體的移動不是通過直向的穿流,而是基于層析作用的橫向流動。GICA是將各種反應(yīng)試劑以條帶狀固定在同一試紙條上,待檢標本加在試紙條的一端,將一種試劑溶解后,通過毛細作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸,樣品中的待測物同層析材

4、料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶),通過可目測的膠體金標記物得到直觀的顯色結(jié)果。而游離標記物則越過檢測帶,達到與結(jié)合標記物自動分離之目的。GICA特點是單一試劑,一步操作,全部試劑可在室溫長期保存。這種新的方法將膠體金免疫檢測試驗推進到一個嶄新的階段?！　《?、GICA試劑的制作　　1·試劑:為試紙條形式。在試紙條的塑料片上依次粘貼如下組分:(1)吸水紙(加樣區(qū)),(2)玻璃纖維膜,膜上吸附著干燥的金標抗體(流動帶),(3)硝酸纖維素膜,膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標記物直

5、接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶(檢測帶),(4)吸水紙。以上各組份首尾互相銜接。因此在(1)處滴加液體標本,液流即向(4)處移動。當液體到達(2)處時,金標抗體被溶解,同時與標本中的抗原反應(yīng)形成復(fù)合物。液流繼續(xù)前移至(3)時,帶有金標記的復(fù)合物被膜上的抗體捕獲,呈現(xiàn)紅色的線條。未結(jié)合的金標抗體繼續(xù)前移至(4)處。　　2·GICA制作中須注意的幾個問題:GICA檢測的可靠性主要依賴于所用試劑的質(zhì)量。其中層析材料的選擇、處理以及受體固定是免疫層析條研制的關(guān)鍵技術(shù)。微孔濾膜:層析反應(yīng)是以濾膜為載體,所以濾膜的質(zhì)量致關(guān)重要。其吸附性能、過濾速度等均會影響檢測結(jié)果。有些濾膜很

6、難達到各部分性質(zhì)均一的質(zhì)量,因此,應(yīng)仔細篩選優(yōu)質(zhì)濾膜。可選擇的濾膜除硝酸纖維膜外還有尼龍膜、羧化纖維素膜、聚酯膜、純纖維素膜和玻璃纖維膜等多種類型,但硝酸纖維素膜(NCM)運用較多。這主要得益于NCM的2個特性:較高的蛋白吸附容量和良好的親水性。純纖維素膜和羧化纖維素膜也是免疫層析的常用材料,但一般要求預(yù)先對其作化學(xué)處理,使其具有與受體蛋白共價聯(lián)接的特性。　　常用的處理方法有苯醌法[4]、溴化氰法[5]和碳二亞胺法[6]。受體:固定于濾膜的受體要求具備如下幾點性質(zhì):(1)與膜材料的結(jié)合穩(wěn)定性好;(2)有較高的生物活性,因而有足夠的配體捕獲容量;(3)有較高

7、的純度,此為特異性檢測的基礎(chǔ);(4)對于以干態(tài)吸附于流動帶的標記或非標記受體,其可流動性是評價其性能優(yōu)劣的主要指標。往往要求在流動帶加入高效助溶劑,從而使吸附于流動帶的受體具有快速溶解的特性。受體固定工藝:受體固定工藝應(yīng)簡單、有效。如大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)采用機械噴膜,保證制膜快速、穩(wěn)定、一致。受體包被量:篩選最佳的受體包被量是提高檢測敏感度的重要因素之一。在不影響所需靈敏度的前提下可提高固相抗原或抗體的濃度,擴展測定的線性范圍,以減少鉤狀效應(yīng)。　　另外,有些檢測項目如血清肌紅蛋白、肌鈣蛋白和甲胎蛋白等陽性質(zhì)控的閾值高低與檢測的敏感性和特異性密切相關(guān)。這類檢測的質(zhì)控

8、受體包被量還需解決具有臨床診斷意義的“檢測下限”即陰性或陽性分界的