免疫膠體金檢測

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1、膠體金免疫試紙技術(shù)在食品獸藥殘留檢測中應(yīng)用摘要：動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥殘留是威脅人體健康和影響畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素。雖然檢測獸藥殘留的方法很多，但皆因其設(shè)備昂貴、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)而受到限制。而膠體金免疫層析技術(shù)因其快速、靈敏、簡便等特點(diǎn)，在獸藥殘留檢測中廣泛研究與應(yīng)用。論文就膠體免疫層析法的原理，在獸藥殘留檢測中研究應(yīng)用以及發(fā)展前景做了較為詳細(xì)的闡敘。關(guān)鍵詞：膠體免疫層析法；獸藥殘留；檢測引言在殘留毒理學(xué)意義上比較重要的獸藥，按照用途主要有抗微生物類、驅(qū)蟲類、抗球蟲和抗原蟲藥物、抗生素類生長促進(jìn)劑、合成代謝荷爾蒙類生長促進(jìn)劑等[1]。目前，國際上通用的獸藥殘留檢測方法是先采用一種簡便的方法對(duì)待檢

2、樣品進(jìn)行快速初篩，再采用準(zhǔn)確性更高的方法對(duì)初篩為陽性的樣品進(jìn)行確證分析[2].國內(nèi)食品受獸藥污染問題嚴(yán)重，國家和政府對(duì)此已做了大量的投入，但執(zhí)行情況仍不盡人意，造成該現(xiàn)象的主要原因之一是缺乏快速、靈敏、簡便的檢測方法[3]。薄層層析、ELISA法、高效液相色譜、質(zhì)譜檢測技術(shù)，由于上述方法需借助儀器設(shè)備來完成檢測過程時(shí)間較長不適宜現(xiàn)場快速檢測。近年來，膠體金免疫層析法因操作簡單，不需輔助儀器和試劑，3~5分鐘出結(jié)果，并可肉眼判斷等特點(diǎn)。因此它在大批量獸藥殘留現(xiàn)場和初篩檢驗(yàn)中得到研究與應(yīng)用。1膠體金免疫層析法膠體金(colloidalgold)是氯金酸(chloroauricacid)的水溶液

3、，是氯金酸在還原劑如白磷、檸檬酸三鈉等的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定膠體溶液。由于膠體金顆粒具有高電子密度的特性,且顆粒聚集達(dá)到一定密度時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點(diǎn)，因而可以作為免疫層析試驗(yàn)的指示物。因此膠體金免疫層析法是一種以膠體（紅色）作為示蹤標(biāo)記物[4]。讓其與蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，再利用抗原抗體反應(yīng)以達(dá)到檢測目的的一種新型的免疫標(biāo)記方法。GICA主要包括夾心法和競爭抑制法，夾心法包括雙抗體夾心法測抗原和雙抗原法測抗體，主要用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲等的檢測[5]。競爭抑制法主要用于獸藥殘留、類固醇、農(nóng)藥等小分子（抗原）的檢測[6]。1.1膠體金試紙條

4、膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝化纖維膜（NC）、聚酯膜、尼龍膜和PVDF膜等，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即可直接使用，周文達(dá)等[7]通過化學(xué)法證明活化后的NC膜可大大提高檢測穩(wěn)定性和靈敏度。將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下晾干備用。NC膜可捕獲一定量的包被（抗體）和二抗作為檢測線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定于PVC板，即成試紙條[8]。試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封保存。密封的測試條室溫下一般可保存6~18個(gè)月。1

5、.2膠體金免疫層析法檢測原理1.2.1競爭法的工作原理[9]待測物與檢測線上包被的抗原或抗體競爭結(jié)合吸附在金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體或抗原。例如，一個(gè)陽性樣本，待測物與檢測線上包被的抗體可競爭結(jié)合金標(biāo)抗體表面有限的抗原位點(diǎn)。隨著時(shí)間的推移，待測物逐漸增多，結(jié)合的金標(biāo)抗體越多，導(dǎo)致檢測線的抗原無法結(jié)合到金標(biāo)抗體。當(dāng)檢測線上的金標(biāo)抗體少到一定程度時(shí)，已經(jīng)無法達(dá)到顯色的濃度，此時(shí)檢測線呈淡色或無色。剩余的金標(biāo)抗體繼續(xù)層析，由于質(zhì)控線上的二抗與抗原不存在競爭位點(diǎn)關(guān)系，當(dāng)金標(biāo)抗體到達(dá)質(zhì)控線(C線)時(shí)，與C線上包被的二抗結(jié)合并不斷累積，直到顯色。所體現(xiàn)的陽性結(jié)果為：T線變淺或消失，C線顯色;陰性結(jié)果為T、C線

6、都顯色；檢測線和質(zhì)控線均不顯色則為失效。1.2.2雙抗體夾心法的工作原理[10]待測物的2個(gè)不同抗原位點(diǎn)分別針對(duì)單克隆金標(biāo)抗體和檢測線單克隆抗體。例如，一個(gè)陽性樣本，待測物可同時(shí)與金標(biāo)單抗和檢測線單抗結(jié)合成一個(gè)雙抗體夾心待測物的大分子，這個(gè)巨型分子由于固定在檢測線的單抗上而在檢測線聚集，當(dāng)聚集足夠多的膠體金時(shí)可被肉眼觀察。隨著待測物的增多，多余的金標(biāo)抗體繼續(xù)層析，質(zhì)控線包被的是金標(biāo)抗體的二抗，當(dāng)多余的金標(biāo)抗體層析到質(zhì)控線(C)時(shí)，與C線上的二抗結(jié)合并不斷積累直到顯色。所呈現(xiàn)的陽性結(jié)果：為C線T線雙顯色；陰性結(jié)果為：T線消失C線顯色。檢測線和質(zhì)控線均不顯色則為失效。1.2.3間接法的工作原理

7、[11]間接法一般用于檢測抗體，與雙抗體夾心法有相同的原理，不同的是以待測抗體的抗原蛋白包被檢測線，以待測抗體的多克隆抗體包被膠體金，以金標(biāo)抗體的二抗包被檢測線。檢測過程中，例如一個(gè)陽性樣本，待測樣本中的抗體先與金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，經(jīng)過檢測線上包被的抗原時(shí)，待測抗體與抗原結(jié)合，不斷積累膠體金直至發(fā)出顯色信號(hào)。多余的金標(biāo)多克隆抗體層析至質(zhì)控線時(shí)與包被在質(zhì)控線的金標(biāo)多抗的二抗結(jié)合，累積后顯色。所呈現(xiàn)的陽性結(jié)果為T線C線雙顯色