免疫膠體金測試原理

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1、免疫膠體金測試原理免疫膠體金技術(shù)是指以膠體金為標記物，應(yīng)用于免疫組織化學及免疫分析中，對細胞或某些標本中的多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、激素和核酸等生物大分子進行定位及定性檢測的一種免疫學技術(shù)。雖然免疫膠體金呈現(xiàn)多種多樣的應(yīng)用形式，但以免疫膠體金為基礎(chǔ)研發(fā)生產(chǎn)的用于疾病檢測和診斷的的快速檢測試劑主要分兩大類，一類是滲濾法（FlowThroughimmunodiagnostictest）,或稱為滴金免疫滲濾實驗（Dotimmunogoldfiltrationassay）,它可以理解為一種以免疫膠體金代替酶標抗體的斑點ELISA。另一類是免疫層析法

2、（immunochromatographicassay），是一種側(cè)向橫流形式的免疫實驗（lateralflowimmunodiagnostictest）。這兩類所涉及的原理基本是相同的，但前者操作稍為復雜，目前在研究、開發(fā)、生產(chǎn)及使用領(lǐng)域占主導地位的，主要是層析法檢測試劑，本文僅就層析法免疫膠體金檢測試劑的原理作一總結(jié)。免疫膠體金的制備原理膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，金離子還原后聚合成的一定大小的金顆粒，它由一個基礎(chǔ)的晶核（11個金原子形成的二十面體）和包圍在外的雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為負離子層

3、AuCl2－，外層是帶正電荷的H＋）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，它還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領(lǐng)域。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到

4、膠體金顆粒表面的包被過程。用于膠體金標記的蛋白必須要經(jīng)過前處理，其目的在于（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過?。?0kD），形成的蛋白復合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被認為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對活性影響的結(jié)

5、構(gòu)部分是提高標記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如牛當?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊螅又_定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值。對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的探針。在高濃度電解質(zhì)（如NaCl）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些探針的實際情況并不完全如此，最穩(wěn)定的探針并不完全代表活性最好，這要靠實驗驗證。在確定最佳pH值后，最后要確定最小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的最

6、小量。如果在制備探針時加入太多的蛋白，不僅造成浪費，而且更為嚴重的是容易造成探針凝聚，并嚴重影響標記活性。因為探針溶液中的游離蛋白容易搶先與標記位點結(jié)合，起到“封閉”（Blocking）作用，而膠體金探針標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。膠體金具有很高的動力學穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的

7、高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。.當金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點或略高時又變得穩(wěn)定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/mlPEG20000作為穩(wěn)定劑。在4～10℃貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。層析法免疫膠體金檢測試劑的組成和結(jié)構(gòu)膠體金作為免疫標記物始于1971年，由Faulk和Taylor將其引入免

8、疫化學。Faulk和Taylor首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細胞化學技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原。此后，他們還把膠體金與抗膠原血清，植物血凝素