高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定深海魚油中dha含量

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1、高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定魚油中DHA含量深海魚油因富含EPA(20:5)和DHA(22:6)等ω-3類的多不飽和脂肪酸而極具營(yíng)養(yǎng)保健和臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值。近二十余年的醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明:EPA,DHA具有調(diào)節(jié)免疫,增強(qiáng)記憶,改善神經(jīng)傳導(dǎo)的功能和預(yù)防中風(fēng)、心肌梗塞和動(dòng)脈硬化的作用,并且是嬰幼兒大腦發(fā)育所必須的物質(zhì)。DHA常用的檢測(cè)方法有氣相色譜法和液相色譜法。氣相色譜法在測(cè)定前需進(jìn)行衍生化,但DHA屬于長(zhǎng)鏈的多不飽和脂肪酸,不易氣化,需要較高溫度條件;而當(dāng)前報(bào)道的液相色譜的檢測(cè)方法也都要經(jīng)過(guò)衍生化處理。這些方法由于測(cè)定步驟多,在長(zhǎng)時(shí)間的處理過(guò)程中極易帶來(lái)DHA的同分

2、異構(gòu)化及多不飽和鍵的氧化;同時(shí),由于魚油中成分非常復(fù)雜,雜質(zhì)峰干擾較大,給DHA含量的準(zhǔn)確測(cè)定帶來(lái)了困難。而采用高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用的方法測(cè)定魚油及其制品中的DHA含量,具有流動(dòng)相簡(jiǎn)單,分析時(shí)間短,且不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生,操作簡(jiǎn)便,定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好。所建立方法的優(yōu)點(diǎn)是質(zhì)譜分析不受色譜分離時(shí)間的限制并可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的重復(fù)分析。一、試驗(yàn)部分(一)儀器與試劑液相色譜儀(配有自動(dòng)進(jìn)樣器),質(zhì)譜檢測(cè)器(配有電噴霧電離源,ESI)DHA標(biāo)準(zhǔn)品,魚油樣品,甲醇為色譜純?cè)噭?其余試劑均為分析純。(二)液相色譜/質(zhì)譜條件表1:液相色譜條件色譜柱柱溫(℃)流動(dòng)相流速(mL/min

3、)進(jìn)樣體積(uL)C8柱21×150mm.id(填料粒度5um)35甲醇:水(80:20)0.35表二:質(zhì)譜條件離子源m/z范圍(amu)毛細(xì)管電壓(kV)錐孔電壓(V)萃取電壓(V)ESI電離源,電噴霧離子化負(fù)離子采集模式(ESI-)200~8003.5254.0射頻電壓(V)源溫度(℃)脫溶劑溫度(℃)脫溶劑氣(L/h)選擇離子(m/z)0.5103300280269,301,27locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang

4、,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取DHA標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中,甲醇定容,得標(biāo)準(zhǔn)品的混合儲(chǔ)備液。精密吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入相同體積的內(nèi)標(biāo)物溶液,適量稀釋至最終濃度DHA為0.90,1.80,3.60,5.40,7.20,9.00ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。HPLC-ESI/MS測(cè)定,以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo),待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析

5、,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)樣品處理2g的魚油樣品,加入50mLNaOH乙醇水溶液(2M),充氮保護(hù),65℃回流1h,加入10mL蒸餾水和20mL正己烷萃取未皂化物2次,水化層用3M的HCl10mL酸化,正己烷20mL×3萃取水解出的游離多不飽和脂肪酸,過(guò)無(wú)水Na2SO440℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑,甲醇定容置棕色容量瓶,直接進(jìn)高效液相色譜/質(zhì)譜儀檢測(cè)。一、討論與結(jié)果分析(一)內(nèi)標(biāo)物的選擇為了消除儀器不穩(wěn)定及進(jìn)樣誤差,對(duì)樣品進(jìn)行定量必須引入內(nèi)標(biāo),這種內(nèi)標(biāo)必須是目標(biāo)物中沒(méi)有的組分并與目標(biāo)物具有盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)

6、特征,且能與目標(biāo)組分充分分離。在通過(guò)對(duì)試驗(yàn)所用魚油樣品的成分分析及比較選擇后,選用十七酸C17:0作為內(nèi)標(biāo)物。(二)分離條件的選擇魚油中含有多種性質(zhì)相近的多不飽和脂肪酸,很難用常規(guī)的方法分離,由于與LC相連的是高選擇性高靈敏度的MS,即使液相沒(méi)有分離,對(duì)魚油樣品中的EPA/DHA的選擇離子進(jìn)行監(jiān)測(cè),也能準(zhǔn)確定性定量。選用不同的分析柱,改變不同的流動(dòng)相配比,選擇較佳的快速分離條件。試驗(yàn)表明:當(dāng)甲醇:水為80:20,梯度洗脫15min到100:0時(shí),魚油樣品中DHA之間及其與內(nèi)標(biāo)物間達(dá)到理想的基線分離。(三)質(zhì)譜條件的優(yōu)化為得到最佳質(zhì)譜響應(yīng),提高其靈敏度,利用流動(dòng)注

7、射法(flowinjectionanalysis,FIA)對(duì)其質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。所測(cè)目標(biāo)組分為脂肪酸,結(jié)構(gòu)中有-COOH,在負(fù)離子模式下有較好響應(yīng)。根據(jù)各參數(shù)對(duì)其響應(yīng)和裂解方式的影響情況,主要對(duì)錐孔電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)錐孔電壓在30V時(shí),響應(yīng)達(dá)到最大值,超過(guò)30V,其響應(yīng)信號(hào)反而減小,碎片離子增加。適量調(diào)節(jié)其他質(zhì)譜條件,進(jìn)一步優(yōu)化。最后確定質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表二。(四)質(zhì)譜分析locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1of

8、whichliquorw

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