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《CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞體外成軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞體外成軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的：應(yīng)用軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMP1）體外誘導(dǎo)SD大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨方向分化，探討其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性以及CDMP1誘導(dǎo)的最佳劑量.方法：無(wú)菌取8只SD大鼠腹股溝脂肪組織，脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)至第二代，以1×104/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板里，12h后加入誘導(dǎo)液（10mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)液,CDMP1），分ABCD四組（A組：50μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液;B組：100μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；C組
2、：150μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；D組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液），以D組為陰性對(duì)照組.誘導(dǎo)14d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT法測(cè)定CDMP1對(duì)其增殖分化能力的影響，行甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫組化染色.結(jié)果：誘導(dǎo)后可見(jiàn)脂肪干細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭型明顯向軟骨細(xì)胞的多角形方向轉(zhuǎn)變.MTT法測(cè)定CDMP1對(duì)脂肪干細(xì)胞的增殖能力提高，其中以C組為最，但ABC三組之間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故提示CDMP1誘導(dǎo)的最佳濃度約為50μg/L.甲苯胺藍(lán)染色法示糖胺聚糖（GAG）均勻分布于基質(zhì)中，免疫組化示誘導(dǎo)組Ⅱ型膠原
3、表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá).結(jié)論：CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞可以分泌軟骨特異性基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原，并使其向軟骨方向增殖分化，以50μg/L為CDMP1誘導(dǎo)的最佳濃度，并有望成為軟骨組織工程種子細(xì)胞的新來(lái)源的方法之一.【關(guān)鍵詞】軟骨形態(tài)，發(fā)生蛋白；脂肪干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；膠原Ⅱ型0引言創(chuàng)傷、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)以及關(guān)節(jié)軟骨病都能造成軟骨組織損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量.而關(guān)節(jié)軟骨的損傷是不易修復(fù)的.由于軟骨自發(fā)修復(fù)能力的局限性,輕度關(guān)節(jié)軟骨損傷會(huì)使損傷發(fā)展甚至退變.關(guān)節(jié)軟骨的退變是臨
4、床的挑戰(zhàn)之一，它缺乏令人信服的治療策略［1］.最近，組織工程作為一種新方法的出現(xiàn)，它是聯(lián)合種子細(xì)胞，支架和生物活性因子，建造功能性的新組織來(lái)代替損傷軟骨.這就使人們致力于理想的種子細(xì)胞，支架材料和生物活性因子的的研究當(dāng)中.Katayama等［2］用CDMP1基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，在用CDMP1轉(zhuǎn)染同源BMMC植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處8wk后，修復(fù)的軟骨表面形態(tài)可以與分化成熟的透明軟骨相比擬，而且軟骨下組織也完全由接近宿主軟骨下骨的新生厚層骨組織修復(fù).這表明CDMP1能誘導(dǎo)骨髓基
5、質(zhì)干細(xì)胞增殖分化成軟骨細(xì)胞.Chang等［3］在小鼠皮下及肌肉內(nèi)注射CDMP1可誘導(dǎo)軟骨組織形成，提示CDMP1具有誘導(dǎo)中胚層來(lái)源間質(zhì)組織分化成軟骨的能力.本實(shí)驗(yàn)我們利用CDMP1體外誘導(dǎo)SD大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向增殖分化，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌軟骨細(xì)胞特異性基質(zhì)的能力，探索CDMP1誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的合適劑量，為軟骨組織工程提供一種新的種子細(xì)胞來(lái)源方法.1材料和方法51.1材料新生牛血清（GIBCO），高糖DMEM（GIBCO），CDMP1（美國(guó)），MTT（Sigma），II型膠原單克隆抗體（
6、博士德），即用型SABC試劑盒（博士德），倒置相差顯微鏡.7日齡SD仔鼠8只，雌雄不限（購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）.1.2方法1.2.1ADSCs的分離、原代培養(yǎng)和傳代無(wú)菌條件下切取SD仔鼠腹股溝的脂肪組織，剔去細(xì)血管，DHanks液反復(fù)吹洗，剪碎脂肪組織，1000r/min離心8min，棄上清，加入1倍體積的10mg/L膠原酶Ⅰ37℃消化60min,用等體積的10mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)液中和，過(guò)200目篩網(wǎng)，900r/min離心8min，棄上清，加10mL/L新生牛血清DM
7、EM培養(yǎng)液，小心吹打約100次，分裝接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，置37℃50mL/LCO2的培養(yǎng)箱里孵育.24h后首次換液，棄去未貼壁的細(xì)胞.以后每2d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)傳代，用2.5g/L胰蛋白酶37℃消化約5min,10mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)液中和，900r/min離心8min.最后以1×104/cm2密度接種于新的25cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育，每隔2d換液1次.1.2.2細(xì)胞爬片及成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)取生長(zhǎng)良好的第二代ADSCs細(xì)胞以1×10
8、3個(gè)/孔的密度接種于2塊（第一塊用來(lái)做免疫組化，第二塊用來(lái)做甲苯胺藍(lán)染色）24孔的培養(yǎng)板里，孔底放置由多聚賴(lài)氨酸包被的蓋玻片.每板分ABCD四組:對(duì)照組（D組）加基礎(chǔ)培養(yǎng)液（10mL/L新生牛血清DMEM）培養(yǎng)，誘導(dǎo)組（A，B，C組）于細(xì)胞爬片12h后，分別加入相應(yīng)的誘導(dǎo)液（A組：50μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；B組：100μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液;C組：150μg/L+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）.每2d換液一次.37℃CO2箱里培養(yǎng)14d.1.2.3MTT法測(cè)定CDMP1對(duì)ADSCs增殖的影響取
