cdmp1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞體外成軟骨細(xì)胞的實驗研究

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1、CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞體外成軟骨細(xì)胞的實驗研究【摘要】目的：應(yīng)用軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMP1）體外誘導(dǎo)SD大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨方向分化，探討其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性以及CDMP1誘導(dǎo)的最佳劑量.方法：無菌取8只SD大鼠腹股溝脂肪組織，脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)至第二代，以1×104/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板里，12h后加入誘導(dǎo)液（10mL/L新生牛血清?DMEM培養(yǎng)液,CDMP1），分ABCD四組（A組：50μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液;B組：100μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；C組：150μg/L

2、CDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；D組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液），以D組為陰性對照組.誘導(dǎo)14d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT法測定CDMP1對其增殖分化能力的影響，行甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫組化染色.結(jié)果：誘導(dǎo)后可見脂肪干細(xì)胞形態(tài)由長梭型明顯向軟骨細(xì)胞的多角形方向轉(zhuǎn)變.MTT法測定CDMP1對脂肪干細(xì)胞的增殖能力提高，其中以C組為最，但ABC三組之間兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義，故提示CDMP1誘導(dǎo)的最佳濃度約為50μg/L.甲苯胺藍(lán)染色法示糖胺聚糖（GAG）均勻分布于基質(zhì)中，免疫組化示誘導(dǎo)組Ⅱ型膠原表達(dá)陽性，對照組未見陽性表達(dá).結(jié)

3、論：CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞可以分泌軟骨特異性基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原，并使其向軟骨方向增殖分化，以50μg/L為CDMP1誘導(dǎo)的最佳濃度，并有望成為軟骨組織工程種子細(xì)胞的新來源的方法之一.【關(guān)鍵詞】軟骨形態(tài)，發(fā)生蛋白；脂肪干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；膠原Ⅱ型0引言創(chuàng)傷、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)以及關(guān)節(jié)軟骨病都能造成軟骨組織損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量.而關(guān)節(jié)軟骨的損傷是不易修復(fù)的.由于軟骨自發(fā)修復(fù)能力的局限性,輕度關(guān)節(jié)軟骨損傷會使損傷發(fā)展甚至退變.關(guān)節(jié)軟骨的退變是臨床的挑戰(zhàn)之一，它缺乏令人信服的治療策略［1］.最

4、近，組織工程作為一種新方法的出現(xiàn)，它是聯(lián)合種子細(xì)胞，支架和生物活性因子，建造功能性的新組織來代替損傷軟骨.這就使人們致力于理想的種子細(xì)胞，支架材料和生物活性因子的的研究當(dāng)中.Katayama等［2］用CDMP1基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，在用CDMP1轉(zhuǎn)染同源BMMC植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處8a），II型膠原單克隆抗體（博士德），即用型SABC試劑盒（博士德），倒置相差顯微鏡.7日齡SD仔鼠8只，雌雄不限（購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）.1.2方法1.2.1ADSCs的分離、原代培養(yǎng)和傳代無菌條件下

5、切取SD仔鼠腹股溝的脂肪組織，剔去細(xì)血管，D?Hank?s液反復(fù)吹洗，剪碎脂肪組織，1000r/min離心8min，棄上清，加入1倍體積的10mg/L膠原酶Ⅰ37℃消化60min,用等體積的10mL/L新生牛血清?DMEM培養(yǎng)液中和，過200目篩網(wǎng)，900r/min離心8min，棄上清，加10mL/L新生牛血清?DMEM培養(yǎng)液，小心吹打約100次，分裝接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，置37℃50mL/LCO2的培養(yǎng)箱里孵育.24h后首次換液，棄去未貼壁的細(xì)胞.以后每2d換液1次，待細(xì)胞生長融合至80%時傳代，用2.5

6、g/L胰蛋白酶37℃消化約5min,10mL/L新生牛血清?DMEM培養(yǎng)液中和，900r/min離心8min.最后以1×104/cm2密度接種于新的25cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育，每隔2d換液1次.1.2.2細(xì)胞爬片及成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)取生長良好的第二代ADSCs細(xì)胞以1×103個/孔的密度接種于2塊（第一塊用來做免疫組化，第二塊用來做甲苯胺藍(lán)染色）24孔的培養(yǎng)板里，孔底放置由多聚賴氨酸包被的蓋玻片.每板分ABCD四組:對照組（D組）加基礎(chǔ)培養(yǎng)液（10mL/L新生牛血清?DMEM）培養(yǎng)，

7、誘導(dǎo)組（A，B，C組）于細(xì)胞爬片12h后，分別加入相應(yīng)的誘導(dǎo)液（A組：50μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；B組：100μg/LCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液;C組：150μg/L+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）.每2d換液一次.37℃CO2箱里培養(yǎng)14d.1.2.3MTT法測定CDMP1對ADSCs增殖的影響取第2代ADSCs細(xì)胞，以1×103個/孔密度接種于5塊平底96孔培養(yǎng)板里.每板分ABCD四組，對照組(D組)加基礎(chǔ)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組（A，B，C組）加相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液（具體同1.2.2）.每隔1d檢測1塊，分析CDMP1對ADSCs的

8、增殖能力的影響.1.2.4Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)的檢測細(xì)胞爬片第14d，取第一塊24孔培養(yǎng)板，取出蓋玻片，950mL/L乙醇固定15min，PBS洗2遍，30mL/LH2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，5g/LBSA封閉37℃25min，濕盒內(nèi)加1∶100的一抗（兔抗大鼠II型膠原單克隆抗體），4℃過夜.濕盒內(nèi)加二抗（兔IgG），37℃30min.PBS漂洗后，二胺基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木