胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)、分化及鑒定.doc

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1、胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)、分化及鑒定作者：胡曉霞，朱筑霞，陳剛，譚新杰【摘要】　　目的：建立胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細胞體外分離、培養(yǎng)、分化及鑒定的方法，探討神經(jīng)干細胞的基本生物學(xué)特性。方法：取孕14d胎鼠大腦皮層，吸管吹打機械分離制成單細胞懸液，采用無血清培養(yǎng)和胎牛血清誘導(dǎo)分化，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)干細胞及其分化的子代細胞。結(jié)果：從胎鼠大腦皮層分離的細胞呈神經(jīng)巢蛋白（Nestin）免疫陽性并能在體外傳代培養(yǎng)，血清誘導(dǎo)分化后的細胞可表達神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞的特異性抗原微管相關(guān)蛋白2和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，誘

2、導(dǎo)分化成的神經(jīng)元能表達突觸的特異性標志Synatophymin。結(jié)論：分離和培養(yǎng)的細胞能表達神經(jīng)干細胞的特異性標志物Nestin，并且具有很強的增殖能力和多向分化潛能，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細胞。【關(guān)鍵詞】干細胞大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)細胞分化胚胎大鼠SpragueDawley　　［Abstract］Objective:Toestablishamethodforisolation,cultivation,differentiationinduction,andidentificationofneuralstemce

3、lls(NSCs)fromembryonicratinvitro,andexplorethebasicbiologicalfeaturesofthesecells.Methods：Themesencephalonofratwithconceptusageof13dayswastakenoutanddissociatedintosinglecellsuspensionmechanically,andthenculturedinserumfreemedium.Fetalbovineserumwasusedtoi

4、nducecelldifferentiation.Theisolatedcellsandtheirprogenywereobservedbyusingimmunofluorescencetechnique.Result：Theisolatedcellsshowednestinpositivereactionandcouldbeculturedinvitroinseries.Afterbeinginducedbyfetalbovineserum,microtubuleassociatedprotein2(MA

5、P2)andglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)whicharespecificantigensinneuronandastrocyteexpressedinthesecells,andsynatophymin,aspecificsignalofsynapse,wasalsoexpressedinthedifferentiatedneurons.Conclusion：TheisolatedandculturedcellsareNSCsofcentralnervoussyste

6、m,andpossessstrongcapabilityofproliferationandpotencyofmultidirectionaldifferentiation.　?。跭eywords］stemcells;cerebralcortex;cellculture;celldifferentiation;embryo;rats,spraguedawley　　傳統(tǒng)觀念認為，哺乳動物的神經(jīng)組織只有死亡，沒有再生能力。自從上世紀90年代初科學(xué)家們分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells,NS

7、Cs）以來,人們相繼從各種動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離、培養(yǎng)了NSCs[1,2]5。NSCs的發(fā)現(xiàn)不僅打破了神經(jīng)元不會再生的傳統(tǒng)觀念，而且為許多以往難以治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療思路和途徑。2007年6月利用細胞分離、無血清培養(yǎng)、血清誘導(dǎo)分化及免疫熒光等技術(shù)，證明了本實驗所分離的細胞群為NSCs，以期為進一步使用和研究NSCs奠定理論及實驗基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料　　DMEM/F12、B27、胎牛血清購自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗體、突觸素抗體Snaptophysin購自SIGM

8、A公司，MAP2抗體、GFAP抗體購自SantaCruzBiotechnology公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為NIKON公司產(chǎn)品?！　?.2NSCs的分離培養(yǎng)[3～5]　　成年雌性和雄性SD大鼠各1只,體重220～260g,雌雄合籠后,檢查陰栓,見陰栓計為孕0d；孕14d時取胎鼠,在解剖顯微鏡下仔細分離獲得胎鼠大腦皮層,再用DHanks液漂洗,用眼科剪反復(fù)切割組織,再用200目細胞篩過濾,