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1、胎鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與分化作者：劉兵，歐微，劉洪濤單位：長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州）（長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院荊州市第一人民醫(yī)院，湖北荊州）（長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州）【摘要】目的：探索從胚胎小鼠額葉皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法。方法：無菌條件下分離孕13?15d小鼠胚胎額葉皮質(zhì)腦組織，經(jīng)消化及機(jī)械吹打成單細(xì)胞后接種于含有B27、bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴(kuò)增;倒置顯微鏡觀察比較生長狀況;機(jī)械分離法傳代;10%血清接種分化;免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的分化方向，結(jié)果：培養(yǎng)的部
2、分細(xì)胞體外分裂增殖，同時表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原nestin,并向神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分化。結(jié)論：小鼠胚腦存在具有多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，它們能在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代和分化，為細(xì)胞替代治療提供了理想的細(xì)胞來源?！娟P(guān)鍵詞】神經(jīng)干細(xì)胞;培養(yǎng);分化;胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells,NSCs）是一類廣泛存在于胚胎及成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期未分化細(xì)胞，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)的&ldquo：發(fā)源地”[1]□近年來隨著對NSCs研究的深入，利用NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性疾病越來越受到廣泛的關(guān)注［2］。
3、如何將神經(jīng)干細(xì)胞在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代，不僅可以為體外研究神經(jīng)干細(xì)胞的分化打基礎(chǔ)，而且可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞替代治療的發(fā)展。木實驗在無血清培養(yǎng)條件下，利用特定的生長因子使胎鼠NSCs穩(wěn)定增殖傳代并分化出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為進(jìn)一步探討小鼠胚胎NSC移植的臨床研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物孕13?15(1昆明小鼠(E13E15SPF級)由武漢大學(xué)實驗動物中心提供。1.1.2試劑與抗體DMEM/F12培養(yǎng)基，特優(yōu)級胎牛血清(FBS),B27均購口GIBCO公司(USA);堿性成纖維生長因
4、子(bFGF)購自Peprotech公司(USA);胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNasel)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購自SIGMA公司(USA)。謝E鼠antinestin,antiNSE,antiGFAP的單克隆一抗體及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗均購自美國AlphaDiagnosticInti.Inc公司；其余試劑均為市購。一次性培養(yǎng)皿(直徑60min)和24孔板購自美國Corning公司。1.2方法1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與分化取孕13~15d昆明小鼠，斷頸處死，75%酒精浸浴2min,無
5、菌剖腹取出胚胎，浸于預(yù)冷0.01MPBS中，解剖顯微鏡下分離胎腦，PBS洗2次，剝盡腦膜，切取額葉腦皮質(zhì)組織塊(每次用胚胎6?8只)。將取下組織轉(zhuǎn)移至試管中，予以0.25%胰酶(Trypsin)和DNA酶37°C恒溫?fù)u床(150rpm)消化5min,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吸管輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，lOOOrpm離心lOmin,棄上清,以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基再次重懸，200目尼龍網(wǎng)過濾，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度以3×105個活細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，加2
6、%B27、10ng/mlbFGF于37°C5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長1周左右，采用機(jī)械方法分離傳代細(xì)胞，離心棄上清液，重懸，計數(shù)接種。一般7d左右傳代一次。取傳2~3代的神經(jīng)干細(xì)胞克隆，置入裝有1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，在僅在含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中口然分化，均每2?3d換液，培養(yǎng)10d后收獲細(xì)胞。1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定將神經(jīng)干細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基種植到多聚賴氨酸包被的載玻片上，對貼壁3h的神經(jīng)球進(jìn)行Nestin染色。對有血清培養(yǎng)1周的神經(jīng)球進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)
7、纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色。檢測方法如下：取出待檢細(xì)胞，純甲醇-20°C固定20min,PBS洗3次，每次5min,0.5%TritonX100透化20min,PBS洗3次;3%H202和羊血清孵育封閉非特異性反應(yīng)，PBS洗3次；一抗分別為Nestin.NSE.GFAP.4°C過夜，次日加入標(biāo)記有Cy3熒光素或FITC熒光素的二抗，37°C孵育lh;PBS洗3次，緩沖甘油封片，日木OLYPUS顯微鏡和德國Lacai共聚焦顯微鏡拍片觀察。2結(jié)果2.1神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分化情況原代培養(yǎng)的皮質(zhì)干細(xì)胞在含B
8、27及bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，早期胞體較小，圓形，未見突起，光鏡下折光性好，晶亮;24h可見大部分細(xì)胞沉底，無突起，由于取材僅限額葉皮質(zhì)細(xì)胞間比較干凈;36h可見沉底的細(xì)胞形成5?10個細(xì)胞的聚集體;2天可見聚集體增大,懸浮，形成十幾個細(xì)胞的神經(jīng)球(neurosphere)(見第77頁彩色圖版I之圖1),以后細(xì)胞球繼續(xù)增大，5?7d細(xì)胞球直徑可達(dá)20~25μm
