構(gòu)建cdna文庫應(yīng)注意的事項(xiàng)

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1、構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫時(shí)應(yīng)當(dāng)注意事項(xiàng)構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫分為噬菌體文庫和質(zhì)粒文庫，二者大同小異。但都應(yīng)當(dāng)注意以下四個(gè)方面：p`EgMzVO,11cCIu一、保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA。)O&zb_{nwOOu/Y構(gòu)建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northernblot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這比直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而構(gòu)建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART4的中級(jí)柱子要求純化后的總mRNA量最好

2、在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個(gè)納克的總RNA也可以構(gòu)建cDNA文庫，但這是針對(duì)材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會(huì)或多或少影響文庫構(gòu)建成功的風(fēng)險(xiǎn)和文庫的代表性。至于RNA的質(zhì)量，如果采用純化總mRNA后反轉(zhuǎn)錄，則對(duì)總RNA的雜質(zhì)方面要求稍松，但對(duì)RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，則對(duì)總RNA的質(zhì)量要求非常高，不僅要求RNA相當(dāng)完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質(zhì)少，最好是試劑盒抽提的。d2TIG<6/

3、Xppv二、反轉(zhuǎn)錄成功與否及反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵。,.h@tN

4、盒及手工方法構(gòu)建中對(duì)文庫的滴度影響不大，但對(duì)文庫的全長(zhǎng)性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉(zhuǎn)錄的新技術(shù)（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證最終獲得全長(zhǎng)cDNA的最好方法，但對(duì)mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結(jié)構(gòu)和PolyA結(jié)構(gòu)的全長(zhǎng)mRNA且反轉(zhuǎn)錄完全，才能進(jìn)入文庫中。反轉(zhuǎn)錄完成后點(diǎn)樣檢測(cè)cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。三、反轉(zhuǎn)錄后至包裝到噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟的操作相對(duì)容易，但其中的層析柱cDNA分級(jí)很關(guān)鍵。這一步稍不注意會(huì)影響成功性或

5、影響獲得的cDNA的片段分布特點(diǎn)。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復(fù)懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級(jí)的cDNA量很少，檢測(cè)時(shí)帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因?yàn)槎唐翁鄷?huì)嚴(yán)重影響后面的連接轉(zhuǎn)化效果及文庫質(zhì)量）。四、噬菌體文庫或質(zhì)粒文庫均對(duì)載體與cDNA的連接效率要求很高，也對(duì)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關(guān)系到文庫構(gòu)建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆

6、的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長(zhǎng)度的載體與固定長(zhǎng)度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長(zhǎng)度的載體與非固定長(zhǎng)度的目的DNA連接，目的基因cDNA長(zhǎng)的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列長(zhǎng)度不等的cDNA與載體在一起連接的結(jié)果，不同長(zhǎng)度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經(jīng)驗(yàn)是，根據(jù)分級(jí)結(jié)果，有意識(shí)地將長(zhǎng)度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染大腸桿菌，分別完成滴度檢測(cè)，最后將不同長(zhǎng)度級(jí)別的文庫混合在一起供雜交篩選。