二園藝植物cdna文庫(kù)的構(gòu)建

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1、二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建3.雙鏈cDNA的合成①自身引導(dǎo)合成法利用新合成的單鏈cDNA3?末端反轉(zhuǎn)所形成的發(fā)夾的雙鏈部分作為引物，引導(dǎo)DNA聚合酶以cDNA為模板，合成互補(bǔ)的第二鏈cDNA，反應(yīng)結(jié)束后，用S1核酸酶降解發(fā)夾環(huán)的單鏈部分，即可得到雙鏈的cDNA片段。主要缺點(diǎn)是在用S1核酸酶去除發(fā)夾環(huán)時(shí)的反應(yīng)條件要求極為苛刻，難以控制，目前已極少采用。二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建3.雙鏈cDNA的合成②置換合成法利用RnaseH將雜交雙鏈中的mRNA降解,形成多段仍與cDNA第一鏈保持雜交的RNA片段.利用這

2、些RNA片段作為引物,引導(dǎo)合成第二鏈cDNA.隨著合成產(chǎn)物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作為引物的RNA片段均被新合成的互補(bǔ)鏈所置換.通過(guò)DNA連接酶作用,將各段互補(bǔ)鏈連接成完整DNA鏈。除去殘存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的單鏈cDNA,得到一個(gè)雙鏈形式的cDNA片段.該方法直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,避免了中間處理和純化過(guò)程造成的cDNA損失,是目前合成cDNA第二鏈的常用方法.二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1.PCR介導(dǎo)的cDNA文庫(kù)原理:以cDNA第一鏈為模板,設(shè)計(jì)一組引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得多拷貝雙鏈cD

3、NA。優(yōu)點(diǎn)：增加低豐度mRNA的克隆機(jī)會(huì);利用僅有的幾個(gè)細(xì)胞或微量的mRNA建立較大的cDNA文庫(kù)。缺點(diǎn)：PCR合成的片段一般較短，大片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增困難；擴(kuò)增過(guò)程中錯(cuò)誤摻入率甚高；由于PCR對(duì)短片段的擴(kuò)增效率高于長(zhǎng)片段，故mRNA的原始豐度難以在文庫(kù)中體現(xiàn)。應(yīng)用：適合于克隆來(lái)源困難的組織或細(xì)胞的基因。(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建2.標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)定義:某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中,且含量相等的cDNA文庫(kù)。優(yōu)點(diǎn)：增加了克隆豐度極低的mRNA的機(jī)會(huì)。能發(fā)現(xiàn)普通cDNA探針?biāo)荒馨l(fā)現(xiàn)的稀有轉(zhuǎn)錄區(qū)。能估計(jì)大多數(shù)基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)組織特異性基因。二、園藝

4、植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建2.標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法用基因組DNA做選擇雜交,所捕獲的cDNA豐度與對(duì)應(yīng)的基因組DNA豐度一致,其缺點(diǎn)是約20%的非單一拷貝基因在構(gòu)建的文庫(kù)中豐度偏高。根據(jù)cDNA退火的二級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，即稀有拷貝的cDNA較豐度拷貝的cDNA復(fù)性或雜交慢,使未復(fù)性部分的單鏈cDNA漸趨等化。三、目的基因的篩選1.根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選根據(jù)基因序設(shè)計(jì)引物,以基因組DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄的cNDA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.如果得到的只是基因部分序列,可以將其克隆至載體,作為探針篩選cDNA文庫(kù)和基

5、因組文庫(kù)獲得全長(zhǎng)基因.用探針直接篩選庫(kù),若能得到其它植物已分離的相關(guān)基因,則可以直接用作探針篩選cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù),獲得研究植物的目的基因.三、目的基因的篩選2.根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選如果已知基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的氨基酸序列,就可以反推出原來(lái)基因的核苷酸序列。從N端對(duì)10多個(gè)連續(xù)的氨基酸進(jìn)行序列測(cè)定，選擇連續(xù)6個(gè)以上簡(jiǎn)并程度最低的氨基酸，按各種可能的序列結(jié)構(gòu)合成寡核苷酸探針庫(kù)，從cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)中篩選全長(zhǎng)的基因.缺點(diǎn):在實(shí)驗(yàn)中得到純度高、數(shù)量足夠的目的基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))是很困難的,蛋白質(zhì)測(cè)序也花費(fèi)較高,難度較大.三、目的基因的篩選3.PCR法

6、篩選基因文庫(kù)將基因文庫(kù)分裝96孔培養(yǎng)板.培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別從同一行或同一列孔中吸取少量培養(yǎng)物合并。以此混合物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳的結(jié)果判定相應(yīng)行或列混合孔中是否含有陽(yáng)性克隆。對(duì)含有陽(yáng)性克隆的行或列孔中培養(yǎng)物再次分裝，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。如此反復(fù)操作，直至獲得陽(yáng)性克隆。一、分離基因的程序(一)圖位克隆技術(shù)的定義及原理定義:根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法.原理:首先找到一個(gè)是以與目標(biāo)基因相連的DNA分子標(biāo)記,然后通過(guò)染色體步移技術(shù)克隆分離出目標(biāo)基因.當(dāng)基因與標(biāo)記之間的距離小于基因組文庫(kù)中克隆的平均插入片段大小時(shí),就要可直接篩選

7、到含有目標(biāo)基因的克隆,這種方法稱為染色體登陸(chromosomelanding)一、分離基因的程序(二)分離基因的程序①目的基因的初步定位利用分子遺傳圖譜確定與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。②目的基因區(qū)域的物理作圖將分子標(biāo)記之間的遺傳距離（cM）轉(zhuǎn)化為物理距離(堿基數(shù)),構(gòu)成該基因區(qū)域的物理圖譜.③構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫(kù).用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選大片段基因組文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。一、分離基因的程序(二)分離基因的程序④構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群以陽(yáng)性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫(kù)，獲得含有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段跨疊群⑤目的