簡(jiǎn)述cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法

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1、簡(jiǎn)述cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法1．1?mRNA純化?構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)的第一步是分離在某一給定的組織或細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)的mRNA。mRNA僅占細(xì)胞總RNA的1%～5%，因而需要另外的純化技術(shù)來(lái)富集mRNA。從細(xì)胞總RNA中分離mRNA是根據(jù)實(shí)際上所有真核細(xì)胞mRNA?3’端有一長(zhǎng)的伸展的腺嘌呤核苷，這個(gè)序列被稱為poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA沒(méi)有，poly(A)尾通常有足夠的長(zhǎng)度因而能與人工合成的互補(bǔ)的寡脫氧胸苷酸（oligo(dT)）雜交。正是這種特性使得mRNA從RNA分子的混合物中分離出來(lái)。方法有三種：?·寡脫氧胸

2、苷酸親和層析：即分離mRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法，將一個(gè)寡脫氧胸苷酸（12~18堿基）連接到纖維素的親和層析柱法，總RNA混合物上樣后，mRNA與寡脫氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不結(jié)合并很容易從柱子洗去。用低鹽緩沖液洗柱，己結(jié)合的mRNA很快洗脫出來(lái)。?·溶液雜交：本方案也用寡脫氧胸苷酸－纖維素，但不用層析柱，而是將基質(zhì)直接加到總RNA溶液中。退火和洗滌步驟通過(guò)離心含有RNA沉淀的基質(zhì)在溶液中完成。?·生物素標(biāo)記寡脫氧胸苷酸和鏈霉親和素包被磁性球珠：本方案中，一個(gè)生物素標(biāo)記的寡脫氧胸苷酸酸引物在溶液中與總RNA退火，然后加入以鏈霉親和素包被的

3、磁性球珠，用磁分離器從大量溶液中分離球珠－mRNA復(fù)全體。移去磁分離器，加入洗脫緩沖液，并重復(fù)磁性分離步驟。在無(wú)鹽的狀態(tài)下，寡脫氧胸苷酸引物從mRNA上解離。1.2cDNA的合成與克隆1.2.1?cDNA第一條鏈的合成所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)催化反應(yīng)，有兩個(gè)關(guān)鍵的因素，一個(gè)是mRNA模板，另一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶。?目前商業(yè)化的反轉(zhuǎn)錄酶主要有兩種：一種是禽源反轉(zhuǎn)錄酶(reverse?transcriptase)，另一種是鼠源反轉(zhuǎn)錄酶。兩種酶都無(wú)3’－5’外切酶活性，但禽源反轉(zhuǎn)錄酶有很強(qiáng)的RNAase

4、?H酶活性，鼠源的具有相對(duì)較弱的RNAaseH酶活性。RNAase?H酶活性在反應(yīng)中起負(fù)作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA雜交分子中的RNA。因此一般反轉(zhuǎn)錄過(guò)程都是采用鼠源反轉(zhuǎn)錄酶。GIBCO-BRL公司出品一種鼠源反轉(zhuǎn)錄酶，稱為SUPERSCRIPT反轉(zhuǎn)錄酶，缺少C-末端180個(gè)氨基酸，完全去除了其RNAase?H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。?1.2.2?cDNA第二條鏈的合成?合成cDNA第二條鏈的傳統(tǒng)方法是“自身引導(dǎo)法”，即將第一條鏈合成過(guò)種中形成的cDNA/RNA雜交分子變性，降解RNA，則單

5、鏈cDNA分子的3’末端自身環(huán)化，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。以此為引物，在DNA聚合酶作用下合成第二條鏈。所得到的產(chǎn)物是雙鏈cDNA，在其相當(dāng)于mRNA5’端的地方有一發(fā)卡閉環(huán)結(jié)構(gòu)。然后用單鏈特異性的SI核酸酶消化該環(huán)，得到可供克隆的雙鏈cDNA分子。由于SI酶的消化反應(yīng)難以控制，不可避免地導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5’的序列出現(xiàn)缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故該法基本上己被一些改進(jìn)的方法所代替。主要的改進(jìn)之處是在合成第一條鏈的反應(yīng)體系中加入4mmol/L的焦磷酸鈉，以抑制發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成，這樣便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二條鏈的引物。1.2

6、.3?cDNA的克隆?dscDNA（雙鏈cDNA）合成后，將此DNA與載體（質(zhì)?；蚴删w）組成重組分子，然后轉(zhuǎn)化到受體菌中進(jìn)行擴(kuò)增。cDNA文庫(kù)可用質(zhì)粒載體或噬菌體載體構(gòu)建。質(zhì)粒文庫(kù)具有易于操作的優(yōu)點(diǎn)，但質(zhì)粒文庫(kù)適于篩選10000到50000個(gè)重組子。噬菌體文庫(kù)更適合于篩選較大數(shù)量（>100000）的重組子。載體的選擇還必須考慮一種mRNA在細(xì)胞內(nèi)的含量，即mRNA的豐度。如果要篩選的目的cDNA的mRNA是低豐度mRNA，要用噬菌體載體構(gòu)建文庫(kù)；如果是高豐度mRNA，則可用質(zhì)粒載體。1.2.4?重組子的篩選與鑒定?基因克隆的最后一道程序是

7、從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選含有陽(yáng)性重組子的菌落并鑒定重組子的正確性，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，從而獲得所需基因片段的大量拷貝，進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)，功能或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。?重組子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，載體上的一些篩選標(biāo)志基因的表達(dá)失活，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的某些表型改變，通過(guò)瓊脂平板中添加一些相應(yīng)篩選物質(zhì)，可以直接篩選鑒別含重組子的菌落。例如將cDNA克隆到多數(shù)載體是通過(guò)插入到載體分子上的β－半乳糖苷酶基因（lacZ）內(nèi)完成的。在簡(jiǎn)便的噬菌斑測(cè)試中，插入的DNA破壞了lacZ基因的編碼序列從而導(dǎo)致載體的表現(xiàn)型從藍(lán)色（親本）變成無(wú)色（重組子）。以這種方式可

8、以很容易地確定出現(xiàn)在文庫(kù)中的重組子。