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《cdna文庫(kù)的構(gòu)建方法與原理》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法與原理蛋白質(zhì)是細(xì)胞的功能分子：它們構(gòu)成結(jié)構(gòu)和調(diào)控分子，動(dòng)力和泵蛋白，酶和受體。然而，如果僅用傳統(tǒng)的生化方法確定某一特異蛋白的全序列，或制備足夠量的蛋白進(jìn)行操作和鑒定都是使人厭煩且昂貴的步驟?；蚩寺『瓦z傳工程對(duì)生化領(lǐng)域有很大貢獻(xiàn)。如果只限于將基因組DNA作為材料來(lái)源，由于其中僅2%被認(rèn)為可能編碼蛋白質(zhì)，那么確定蛋白質(zhì)序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)因子、內(nèi)含子、非編譯外顯子和重復(fù)及功能未知的非編碼序列。如果分析僅局限在編碼序列，那么確定基因產(chǎn)物序列所需的努力就會(huì)大大的
2、降低。因此分子生物學(xué)主要原則之一是mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，所以mRNA是確定蛋白質(zhì)序列的理想底物。不幸的是，現(xiàn)有通用的克隆載體沒(méi)有一個(gè)能容納mRNA分子作為插入片段。因此，產(chǎn)生表達(dá)序列文庫(kù)的一個(gè)基本步驟是將mRNA分子轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。來(lái)自mRNA分子的DNA拷貝稱cDNA，由來(lái)自細(xì)胞或組織mRNA種類的DNA拷貝組成的文庫(kù)稱為cDNA文庫(kù)。1．基本原理cDNA（ComplementaryDNA）是以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的互補(bǔ)DNA，它的順序可代表mRNA序列。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建是指
3、將cDNA與克隆載體DNA體外重組，然后去轉(zhuǎn)化克隆載體DNA的宿主細(xì)胞，從而得到一群含重組DNA的細(xì)菌或噬菌體克隆的過(guò)程。這些序列來(lái)自并代表一定組織或細(xì)胞類型特定發(fā)育或分化階段的整個(gè)mRNA群體。其過(guò)程可概括為：（1）通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶將各種mRNA轉(zhuǎn)變?cè)赾DNA；（2）cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入到宿主中。cDNA基因文庫(kù)具有許多優(yōu)點(diǎn)和特殊用途：首先，cDNA克隆以mRNA為起始材料，這對(duì)于有些RNA病毒來(lái)說(shuō)非常適用，因?yàn)樗鼈兊脑鲋巢⒉唤?jīng)過(guò)DNA中間體，研究這樣的生物有機(jī)體，cDNA克隆是唯一可行的方法。第
4、二，cDNA基因文庫(kù)的篩選簡(jiǎn)單易行，恰當(dāng)選擇mRNA的來(lái)源，使所構(gòu)建的cDNA基因文庫(kù)中，某一特定序列的克隆達(dá)到很高的比例，簡(jiǎn)化了篩選特定基因序列克隆的工作量。第三，每一個(gè)cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性幾率比較低，從陽(yáng)性雜交信號(hào)選擇出來(lái)的陽(yáng)性克隆一般含有目的基因序列。第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的測(cè)定，讀碼框（ORF）的界定，只有通過(guò)對(duì)mRNA5’核苷酸序列才能獲得。2．基本方法2．1mRNA純化構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)的第一步是分離在某一給定的組織或細(xì)胞類型表達(dá)的mRN
5、A。mRNA僅占細(xì)胞總RNA的1%～5%，因而需要另外的純化技術(shù)來(lái)富集mRNA。從細(xì)胞總RNA中分離mRNA是根據(jù)實(shí)際上所有真核細(xì)胞mRNA3’端有一長(zhǎng)的伸展的腺嘌呤核苷，這個(gè)序列被稱為poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA沒(méi)有，poly(A)尾通常有足夠的長(zhǎng)度因而能與人工合成的互補(bǔ)的寡脫氧胸苷酸（oligo(dT)）雜交。正是這種特性使得mRNA從RNA分子的混合物中分離出來(lái)。方法有三種：·寡脫氧胸苷酸親和層析：即分離mRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法，將一個(gè)寡脫氧胸苷酸（12~18堿基）連接到纖維素
6、的親和層析柱法，總RNA混合物上樣后，mRNA與寡脫氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不結(jié)合并很容易從柱子洗去。用低鹽緩沖液洗柱，己結(jié)合的mRNA很快洗脫出來(lái)?！と芤弘s交：本方案也用寡脫氧胸苷酸－纖維素，但不用層析柱，而是將基質(zhì)直接加到總RNA溶液中。退火和洗滌步驟通過(guò)離心含有RNA沉淀的基質(zhì)在溶液中完成?！ど锼貥?biāo)記寡脫氧胸苷酸和鏈霉親和素包被磁性球珠：本方案中，一個(gè)生物素標(biāo)記的寡脫氧胸苷酸酸引物在溶液中與總RNA退火，然后加入以鏈霉親和素包被的磁性球珠，用磁分離器從大量溶液中分離球珠－mRNA復(fù)全體
7、。移去磁分離器，加入洗脫緩沖液，并重復(fù)磁性分離步驟。在無(wú)鹽的狀態(tài)下，寡脫氧胸苷酸引物從mRNA上解離。2.2cDNA的合成與克隆2.2.1cDNA第一條鏈的合成所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)催化反應(yīng)，有兩個(gè)關(guān)鍵的因素，一個(gè)是mRNA模板，另一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶。目前商業(yè)化的反轉(zhuǎn)錄酶主要有兩種：一種是禽源反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)，另一種是鼠源反轉(zhuǎn)錄酶。兩種酶都無(wú)3’－5’外切酶活性，但禽源反轉(zhuǎn)錄酶有很強(qiáng)的RNAaseH酶活性，鼠源的具有相對(duì)較
8、弱的RNAaseH酶活性。RNAaseH酶活性在反應(yīng)中起負(fù)作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA雜交分子中的RNA。因此一般反轉(zhuǎn)錄過(guò)程都是采用鼠源反轉(zhuǎn)錄酶。GIBCO-BRL公司出品一種鼠源反轉(zhuǎn)錄酶，稱為SUPERSCRIPT反轉(zhuǎn)錄酶，缺少C-末端180個(gè)氨基酸，完全去除了其RNAaseH酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。2.2.2cDNA第二條鏈的合成合成cDNA第二條鏈的傳統(tǒng)方法是“自身引導(dǎo)法
