吡格列酮對(duì)家兔局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響

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1、吡格列酮對(duì)家兔局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響　　[]目的探討吡格列酮對(duì)腦缺血再灌注損傷家兔細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法40只雄性家兔隨機(jī)分為5組：①假手術(shù)組（S組，n=8）；②模型組（M組，n=8）；③吡格列酮組（P組，n=8）；④GSO組（D組，n=8）。除S組外，其余各組均通過線栓法建立家兔大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）再灌注損傷模型。于術(shù)前30min分別給予相應(yīng)處理。缺血120min再灌注24h后，對(duì)家兔進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分；HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)，TUNEL檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果①與S組比較，M組神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加（P<0.05）；與M組比較，P組神經(jīng)功能評(píng)分明

2、顯降低（P<0.05）。②與S組比較，M組凋亡細(xì)胞明顯增加（P<0.05）；與M組比較，P組凋亡細(xì)胞明顯降低（P<0.05）。結(jié)論吡格列酮可通過減輕形態(tài)學(xué)改變、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用?！　關(guān)鍵詞]吡格列酮；G組）；③吡格列酮組（P組）；④GSO組（D組）?！　?.2試劑　　吡格列酮、GSO）（Sigma公司，美國）；原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；電子顯微鏡（Olympus，日本）等?！　?.3動(dòng)物模型制備及處置　　M組：術(shù)前20min經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水2mL/kg，采用改良的Zea-longa[3]法制備家兔大

3、腦中動(dòng)脈阻斷（MCAO）模型。缺血120min后抽出線栓即可造成再灌注模型。模型成功標(biāo)志：蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner綜合征；爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒。P組：術(shù)前20min經(jīng)耳緣靜脈注射吡格列酮10mg/kg。GP組：術(shù)前20min先經(jīng)耳緣靜脈注射GSO2mL/kg。S組：術(shù)中分離左側(cè)CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血處理。　　1.4指標(biāo)檢測(cè)　　1.4.1神經(jīng)功能評(píng)分再灌注24h后采用雙盲法按Zea-longa5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：①無神經(jīng)功能缺失癥狀，計(jì)0分；②不能伸展右側(cè)前肢，計(jì)1分；③爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)2分；④身體向右側(cè)傾倒，計(jì)3分；⑤不能自發(fā)爬行、意識(shí)障

4、礙，計(jì)4分?！　?.4.2HE染色將各組8只家兔麻醉，以生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗，用4℃10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速斷頭取腦。距額葉前端3mm和9mm處進(jìn)行冠狀分離，取中間6mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側(cè)約2mm處，從上至下切去兩側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，將左側(cè)腦塊作為缺血腦組織，制成蠟塊。自前往后連續(xù)冠狀位切片，厚約5μm。HE染色光學(xué)顯微鏡下（400）觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并采圖。　　1.4.3TUNEL染色嚴(yán)格按照試劑盒檢測(cè)步驟進(jìn)行操作。TUNEL染色在光鏡下（400）觀察凋亡細(xì)胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），計(jì)算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)

5、的比值并采圖。　　1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。神經(jīng)功能評(píng)分中位數(shù)/四分位數(shù)法表示，多組間比較采用Kruskal-組最遲鈍，P組最佳。5組家兔神經(jīng)功能評(píng)分比較見表1?！　?.2HE染色的比較　　切片經(jīng)HE染色后，光鏡下可見S組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)色淡且均勻，核大而圓，核仁明顯（圖1A）。M組呈明顯的缺血損傷性改變，多數(shù)細(xì)胞體積縮小，胞漿疏松，胞核固縮深染，部分細(xì)胞壞死（圖1B）。經(jīng)吡格列酮預(yù)處理的P組缺血性損傷改變較M組明顯減輕，壞死區(qū)域縮小（圖1C），而GP與D組較M組的缺血改變則無明顯減輕，可見神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死（圖1D

6、和圖1E）?！　?.3TUNEL染色的比較　　S組只有少量凋亡細(xì)胞（圖2A），與其余4組大鼠相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。M組凋亡細(xì)胞陽性率為（63.06±9.05%，圖2B），而經(jīng)吡格列酮預(yù)處理的P組相應(yīng)區(qū)域凋亡細(xì)胞陽性率（48.10±7.61%，圖2C），兩組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而GP與D組較M組的細(xì)胞凋亡率則無明顯改變。5組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞率比較見表1。　　3討論　　既往研究表明，腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞可介導(dǎo)大量炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放[5]，造成神經(jīng)元凋亡，從而造成對(duì)缺血損傷區(qū)域細(xì)胞的損傷

7、。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組中細(xì)胞凋亡數(shù)量相比假手術(shù)組顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑能活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶而抑制NF-κB的激活[6]。NF-κB可調(diào)控表達(dá)許多參與炎癥反應(yīng)、氧化損傷、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程的蛋白基因。持續(xù)活化在垂死神經(jīng)元中的NF-κB可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)失敗和生成死亡蛋白[7]；炎癥反應(yīng)過程中釋放一系列細(xì)胞因子信號(hào)降解IκB的激酶（IKK）活化并磷酸化IκB的兩個(gè)Ser殘基，釋放出與I&kapp