人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cdna文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

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1、人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成,確定不同發(fā)育階段的功能基因成為后基因組時(shí)代的重要研究?jī)?nèi)容,而構(gòu)建cDNA文庫(kù)已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一,在分離、克隆、篩選新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7為表達(dá)載體,構(gòu)建了一個(gè)人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù),為今后胃疾病相關(guān)基因的研究工作奠定了基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料　　人GES1細(xì)胞于2009年6月18日購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。Trizol提取試劑購(gòu)自美國(guó)I

2、nvitrogen公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCRTaqMix試劑盒、OligotexdT30mRNAPurificationkit購(gòu)自大連寶生物科技有限公司;其他生化試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)生物公司。護(hù)理論文發(fā)表　　1.2方法　　1.2.1總RNA提取及poly(A)+RNA純化細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至旺盛生長(zhǎng)期,傾盡培養(yǎng)液后直接向培養(yǎng)瓶中加入Trizol試劑(1ml/10cm2),裂解細(xì)胞,并用吸頭將細(xì)胞裂解物吹吸幾次,再經(jīng)氯仿抽提及異丙醇沉淀后,以7

3、5%乙醇洗滌,室溫自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP處理),并在55～60℃放置10min讓其充分溶解。取出一小份稀釋后在紫外分光光度計(jì)下測(cè)RNA含量及純度,并做瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA完整性。以O(shè)ligotexdT30mRNAPurificationkit進(jìn)行mRNA分離純化,實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。　　1.2.2第一鏈cDNA的合成將模板RNA(Poly(A)+RNA)5μg中加入H2O,使其總量達(dá)到9.8μl,于72℃孵育2min,冰中放置2min后在微量離心管中加入5×1stStrand

4、SynthesisBuffer4μl、1stStranddNTPMixture1.2μl、RNaseInhibitor(20U/μl)1.0μl、1μg/μlOligo(dT)18AnchorPrimer[序列為5'(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V3'(V:AorCorG)]2.0μl于室溫放置10min后加入ReverseTranscriptase(MMLV)1.0μl,輕輕混勻,于42℃孵育60min,向反應(yīng)管中加入200U/μlSuperScriptIIIRTase1μl

5、,52℃孵育60min,反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2～5min.　　1.2.3雙鏈cDNA合成在第一鏈cDNA合成液(20μl)中加入5×2ndStrandSynthesisBuffer30μl、2ndStranddNTPMixture4.5μl、RNasefreeH2O87.5μl、E.coliRNaseH/E.coliDNALigaseMixture2μl、E.coliDNAPolymeraseⅠ2μl.用移液槍輕輕混勻后,16℃反應(yīng)2h,70℃加熱10min,室溫放置5min,加入4μl的T4DN

6、APolymerase輕輕攪拌,37℃反應(yīng)10min.經(jīng)PCI抽提、CI抽提后,加入3MSodiumAcetate(pH5.2)15μl,Dr.GenTLEPrecipitationCarrier3μl,100%乙醇400μl,立即進(jìn)行室溫下15000r/min共30min的離心。除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5μl的RNasefreeH2O溶解沉淀?！　?.2.4cDNA與salⅠadaptor的連接向上述雙鏈cDNA溶液3.5μl中加入下列試劑:10×T4DNALigaseBu

7、ffer1μl,0.4μg/μlEcoRIAdaptor3.5μl,350U/μlT4DNALigase1μl,10mmRatp1μl,全量為10μl.輕輕混勻,8℃過(guò)夜反應(yīng),70℃保溫30～45min,室溫放置5min.　　1.2.5限制酶XhoI酶切反應(yīng)向AdaptorLigation溶液中加入:10×Hbuffer5μl,50U/μlXhoI3μl,輕輕混勻,37℃反應(yīng)3h.護(hù)理論文發(fā)表　　1.2.6使用SpinColumn除去短鏈cDNA及文庫(kù)構(gòu)建單鏈(singlestrand,ss)cDNA

8、擴(kuò)增后合成雙鏈(doublestrand,ds)cDNA,dscDNA經(jīng)XhoⅠ酶切及柱層析洗脫,收集0.5～5kb之間的組分,在T4DNA連接酶作用下,與pGADT7去磷酸化臂于16℃水浴中過(guò)夜連接,隨后包裝蛋白包裝載體?！　?.2.7文庫(kù)滴定、重組率測(cè)定和擴(kuò)增按照構(gòu)建的cDNA文庫(kù)滴度文庫(kù)滴定公式[2]:原始文庫(kù)滴度=克隆斑總數(shù)×稀釋倍數(shù)×包裝體積,重組率測(cè)定采用藍(lán)白斑篩選方法,即向含有酵母菌和E.coli.XL1Blue混合液的上層瓊脂中分別加