smart技術(shù)構(gòu)建紅曲霉全長(zhǎng)cdna文庫(kù)論文

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1、SMART技術(shù)構(gòu)建紅曲霉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)論文.freelechanismat5′endofRNAtranscript)技術(shù)構(gòu)建紅曲霉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，經(jīng)涂平板和酶切反應(yīng)測(cè)定文庫(kù)的克隆數(shù)、重組率，PCR測(cè)定插入片斷的大小。結(jié)果原始文庫(kù)的庫(kù)容為2.03×105，重組率達(dá)94%。插入片段大小多在0.7～2.0kb.freeletabolitesinMonascus.MethodsAcDNAlibrary.Thenumberoftheclonesandtherebinationrateofthelibraryinedbyplatecoatingandrestrictivedigestion,and

2、thesizeofinsertedfragmentinedbyPCR.ResultsTheprimarylibrarycapacityentsizeettherequirementforcloningtargetgenesandexpressingtargetproteins.Keyin，培養(yǎng)5d至產(chǎn)生紅曲色素。將菌液離心，沉淀分別用蒸餾水、無(wú)菌水、DEPC水潤(rùn)洗，干燥，稱干重，將樣品放于研缽中，加入液氮，研磨至粉狀。在樣品未融化前加入Trizolreagent，繼續(xù)研磨使樣品溶解。離心，取上清。加氯仿，搖勻，離心，取上清。加異丙醇沉淀RNA。75%(φ)乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干RNA，用無(wú)RN

3、ase水溶解沉淀，-70℃保存。得總RNA。使用紫外分析儀檢測(cè)總RNA濃度、純度，1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。1.2.2雙鏈cDNA的合成廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)第25卷第3期朱碧云，等.SMART技術(shù)構(gòu)建紅曲霉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)在5μL反應(yīng)體系中加入1.0μgtotalRNA、SMARTⅣOligonucleotide(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)1μL、CDSⅢ/3′PCR引物5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N3′(N=A、G、CorT;N-1=A、GorC1μL，用無(wú)RNas

4、e水補(bǔ)足到5μL?；靹颍虝弘x心，72℃，2min;冰上冷卻2min，短暫離心;向反應(yīng)液中加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液2.0μL及20mmol/LDTT、10mmol/LdNTP混合液、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶各1μL于42℃孵育60min，置于冰浴中終止反應(yīng)。取2μL第一鏈產(chǎn)物于干凈預(yù)冷0.2mL反應(yīng)管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為5′PCR引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)、CDSⅢ/3′PCR引物。循環(huán)條件為：首先把PCR儀預(yù)熱到95℃，再20個(gè)循環(huán)：95℃15s，68℃6min。1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并估算其濃度。1.2.3cDNA的分級(jí)分離純化及文

5、庫(kù)構(gòu)建合成的雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切后，柱層析分級(jí)，共收集15管，每管取3μL進(jìn)行1.1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，合并能顯示亮帶的前4管(片段0.4kb)，進(jìn)行沉淀，重懸在去離子水中，加T4DNA連接酶，與質(zhì)粒載體pDNRLIB(經(jīng)SfiⅠ酶處理過(guò))于16℃下連接過(guò)夜。cDNA與載體的比例為1.5∶1。連接產(chǎn)物經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。電擊條件：電擊杯內(nèi)徑0.1cm，電容25μF，電阻200Ω，電壓1.8kV，感受態(tài)25μL,電轉(zhuǎn)儀：BIORADGenePulserXcell電穿孔儀。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到加有1mLLB培養(yǎng)基的試管中，225r/min，37℃，培養(yǎng)1h。

6、1.2.4原始文庫(kù)質(zhì)量鑒定取適量原始文庫(kù)菌液，均勻地涂在含30μg/mL氯霉素的LB平板上，隨機(jī)挑取15個(gè)克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ酶切后電泳檢測(cè)，可測(cè)定其重組率及重組片段的大小。文庫(kù)的擴(kuò)增采用涂平板培養(yǎng)擴(kuò)增。取適量原始文庫(kù)均勻地涂在10個(gè)含30μg/mL氯霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，用含有25%(φ)甘油LB培養(yǎng)基洗脫所有的菌落，2mL/板，將每板的洗脫液混合搖勻即得到了擴(kuò)增文庫(kù)，檢測(cè)其滴度，分裝，放置-80℃保存。2結(jié)果分析2.1總RNA提取提取的樣品總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，A260/A280值為1.77，表明所得總RNA純度較高，但稍有降解。1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示

7、(圖1)，28SrRNA、18SrRNA和5.8SrRNA三條特征條帶清晰，表明總RNA比較完整，也沒有明顯的基因組DNA污染。2.2雙鏈cDNA的合成及分級(jí)合成的雙鏈cDNA產(chǎn)物的1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，成一彌散帶，最大片段超過(guò)10kb，主要集中在0.5～2.5kb(圖2)，表明合成的cDNA是比較完整的。由于較小的非全長(zhǎng)cDNA片斷更容易連接進(jìn)載體，所以需要對(duì)經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理和SfiⅠ酶切后的cDNA進(jìn)行分級(jí)