當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響

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1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響作者：陳鵲汀，劉智勤，朱惠學(xué)，王海波，李中【摘要】目的觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）化療荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，隨機(jī)分為4組，荷瘤對(duì)照組、CTX組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯＋CTX組及當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。造模次日開始給藥，共10d，停藥次日處死，測(cè)定脾臟和胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞活性、T淋巴細(xì)胞增殖能力。結(jié)果當(dāng)歸補(bǔ)血湯可提高化療荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞活性，同時(shí)還對(duì)刀豆素A（ConA）誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用

2、。結(jié)論當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有提高機(jī)體免疫功能，抵御化療所引起的免疫功能下降的作用?！娟P(guān)鍵詞】當(dāng)歸補(bǔ)血湯；腫瘤；免疫功能；化療當(dāng)歸補(bǔ)血湯方出自李東垣《內(nèi)外傷辯惑論·暑傷胃氣論》，為氣血雙補(bǔ)之經(jīng)典名方。研究表明，此方具有增強(qiáng)免疫的效果［1］。但有關(guān)當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)化療荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響報(bào)道較少，我們通過建立S180荷瘤小鼠模型，觀察了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）化療荷瘤小鼠免疫功能的影響，旨在為該方的臨床應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與儀器　　1.1動(dòng)物及細(xì)胞株　　清潔級(jí)昆明小鼠，7～9周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，

3、由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK(冀)2003-1-003。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間自由采食飲水。腹水型S180瘤株由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，L929細(xì)胞株由北京市中醫(yī)研究所提供?！　?.2藥品　　　當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪和當(dāng)歸組成（飲片由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，所有藥品均經(jīng)中藥專家鑒定），將上述藥物加水浸泡20min后，煎煮3次，約30min/次，3煎溶液混合過濾，取汁300ml，離心取上清，80℃水浴濃縮至每毫升含生藥1.2g，分裝，高溫消毒后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆??；熕?/p>

4、物：注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)：06112021)?！　?.3試劑及儀器　　DMSO(Amresco公司產(chǎn)品)，四氮甲唑藍(lán)(MTT，Amresco公司產(chǎn)品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司產(chǎn)品)，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Amresco公司產(chǎn)品)。酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品），CO2培養(yǎng)箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品），超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品）?！　?方法　　2.1動(dòng)物模型的建立［2］　　無菌條件下抽取6～7d生長(zhǎng)良好的S180小鼠的

5、腹水，按1∶3比例用生理鹽水稀釋，反復(fù)沖打，充分混勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107/ml，取0.2ml于每只小鼠右側(cè)腋窩下碘酊消毒后皮下接種。瘤株接種前，均用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)為95%～98%。從抽取腹水時(shí)開始，到移植完最后1只小鼠的總時(shí)間控制在1h內(nèi)?！　?.2分組及給藥　　小鼠接種24h后按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分成荷瘤對(duì)照組、CTX組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯+CTX組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。荷瘤對(duì)照組均用生理鹽水灌胃，同時(shí)腹腔注射生理鹽水，單純化療組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1，同時(shí)用生理鹽水灌胃，當(dāng)歸補(bǔ)血湯+CT

6、X組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1，同時(shí)用當(dāng)歸補(bǔ)血湯12g·kg-1·d-1（按生藥量計(jì)算，劑量由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出）灌胃，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組用當(dāng)歸補(bǔ)血湯12g·kg-1·d-1灌胃，同時(shí)腹腔注射生理鹽水，各組灌胃容積均為0.4ml/只，腹腔注射容積均為0.2ml/只，各組于瘤細(xì)胞接種第2日開始用藥，1次/d，連續(xù)10d?！　?.3脾臟、胸腺指數(shù)　　小鼠脫臼處死，以無菌操作取下脾臟、胸腺，電子天平稱質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)?！　?.4腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定［3］　　小鼠脫臼處死，75%酒精中浸泡2min，置超凈臺(tái)。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml，輕

7、揉腹部2min，回抽腹腔液，離心棄上清。RPM1－1640培養(yǎng)液洗兩次，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，溫PBS液洗并吸出未貼壁細(xì)胞，得到巨噬細(xì)胞單層。于每孔中加入0.03%的中性紅溶液100μl，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，用溫PBS液反復(fù)沖洗未被吞噬的中性紅3次。于每孔中加入細(xì)胞裂解液（1∶1的冰醋酸和無水乙醇)100μl，4℃靜置過夜，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值?！　?.5NK細(xì)胞活性測(cè)定［4］　　無菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含10%小

8、牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液配成1×107/ml濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化