當歸補血湯對荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響論文

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1、當歸補血湯對荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響論文.freelide，CTX）化療荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，隨機分為4組，荷瘤對照組、CTX組、當歸補血湯＋CTX組及當歸補血湯組。造模次日開始給藥.freelide，CTX）化療荷瘤小鼠免疫功能的影響，旨在為該方的臨床應用提供一定實驗依據(jù)。1材料與儀器1.1動物及細胞株清潔級昆明小鼠，7～9周齡，雌雄各半，體質量18～22g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證：SCXK(冀)2003-1-003。動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗期間自由采食飲水。腹水型S180瘤株由河北醫(yī)科

2、大學實驗動物中心提供，L929細胞株由北京市中醫(yī)研究所提供。1.2藥品當歸補血湯由黃芪和當歸組成（飲片由河北大學附屬醫(yī)院中藥房提供，所有藥品均經(jīng)中藥專家鑒定），將上述藥物加水浸泡20min后，煎煮3次，約30min/次，3煎溶液混合過濾，取汁300ml，離心取上清，80℃水浴濃縮至每毫升含生藥1.2g，分裝，高溫消毒后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆??；熕幬铮鹤⑸溆铆h(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號：06112021)。1.3試劑及儀器DMSO(Amresco公司產(chǎn)品)，四氮甲唑藍(MTT，Amresco公司產(chǎn)品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司產(chǎn)品)，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Amr

3、esco公司產(chǎn)品)。酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司產(chǎn)品），CO2培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司產(chǎn)品），超凈工作臺(蘇凈集團，蘇州安泰空氣技術有限公司產(chǎn)品)，倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司產(chǎn)品）。2方法2.1動物模型的建立［2］無菌條件下抽取6～7d生長良好的S180小鼠的腹水，按1∶3比例用生理鹽水稀釋，反復沖打，充分混勻，在顯微鏡下計數(shù)，用生理鹽水調整細胞濃度為1.5×107/ml，取0.2ml于每只小鼠右側腋窩下碘酊消毒后皮下接種。瘤株接種前，均用0.2%臺盼藍染色，計算活細胞數(shù)為95%～98%。從抽取腹水時開始，到移植完最后1只小鼠的總時間控制在1h內。2.2分組及給藥小鼠

4、接種24h后按體質量和性別隨機分成荷瘤對照組、CTX組、當歸補血湯+CTX組和當歸補血湯組。荷瘤對照組均用生理鹽水灌胃，同時腹腔注射生理鹽水，單純化療組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1，同時用生理鹽水灌胃，當歸補血湯+CTX組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1，同時用當歸補血湯12g·kg-1·d-1（按生藥量計算，劑量由預實驗得出）灌胃，當歸補血湯組用當歸補血湯12g·kg-1·d-1灌胃，同時腹腔注射生理鹽水，各組灌胃容積均為0.4ml/只，腹腔注射容積均為0.2ml/只，各組于瘤細胞接種第2日開始用藥，1次/d，連續(xù)10d。2.3脾臟、胸腺指數(shù)小鼠脫臼處死，以無菌操作

5、取下脾臟、胸腺，電子天平稱質量并計算臟器指數(shù)。2.4腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定［3］小鼠脫臼處死，75%酒精中浸泡2min，置超凈臺。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml，輕揉腹部2min，回抽腹腔液，離心棄上清。RPM1－1640培養(yǎng)液洗兩次，計數(shù)并調節(jié)細胞濃度為2×106個/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每樣本均設3個復孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，溫PBS液洗并吸出未貼壁細胞，得到巨噬細胞單層。于每孔中加入0.03%的中性紅溶液100μl，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，用溫PBS液反復沖洗未被吞噬的中性紅3次。于每孔中加入細胞裂解液（1∶1的冰醋酸和無水乙醇)100μl，4℃

6、靜置過夜，用酶標儀在570nm處測定OD值。2.5NK細胞活性測定［4］無菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾細胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液配成1×107/ml濃度作為效應細胞。取傳代培養(yǎng)的L929細胞，用0.25%胰酶消化液消化2min，加入完全RPMI－1640培養(yǎng)液，調細胞濃度為2×105/ml作為靶細胞，在96孔平底板上每孔加入靶細胞懸液100μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)90min，使其貼壁成單層細胞，然后實驗孔加入100μl效應細胞懸液，做4個復孔，靶細胞對照孔加完全RPMI－1640培養(yǎng)液100μl；然后將96孔板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育20h，去上清，用生理

7、鹽水輕輕注滿各孔，反復3次，以除去效應細胞和被殺傷脫落的靶細胞，在濾紙上吸干孔內水分；每孔加入0.1%的中性紅染液100μl，孵育30min，棄去染液，用生理鹽水洗3遍，每孔加100μl細胞裂解液，使含有中性紅的靶細胞溶解，搖勻，用酶標儀在450nm測OD值，用以下公式計算殺傷率。殺傷率(%)=(靶細胞OD值-實驗組OD值)/靶細胞OD值×100%2.6T淋巴細胞增殖能力的測定［5］無菌摘取脾臟，常規(guī)制作脾細