egcg對(duì)人耐藥口腔表皮樣癌細(xì)胞株耐藥逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)

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1、EGCG對(duì)人耐藥口腔表皮樣癌細(xì)胞株耐藥逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)作者：梁鋼，林曉貞，唐安洲，黎莉，周銘【摘要】目的研究EGCG對(duì)人多藥耐藥口腔癌細(xì)胞KBV200的細(xì)胞毒增敏作用及裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)，HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VCR濃度，采用KB和KBV200細(xì)胞分別種植同一裸鼠左、右腋下，觀察用藥后體重、抑瘤率的改變。RTPCR檢測(cè)瘤組織mdr1的表達(dá)。結(jié)果EGCG在100mg·L-1以下劑量對(duì)兩株腫瘤細(xì)胞的抑制率均小于10%，EGCG與VCR聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高VCR的細(xì)胞毒作用；EGCG聯(lián)合VCR作用后KBV200細(xì)

2、胞內(nèi)VCR濃度升高，P糖蛋白的表達(dá)下降；EGCG可增加VCR對(duì)KBV200的抑瘤作用，可降低瘤組織MDR1的表達(dá)量。結(jié)論EGCG可增強(qiáng)VCR對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞KBV200的細(xì)胞毒作用，機(jī)制可能與降低MDR1mRNA、Pgp表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】多藥耐藥；P糖蛋白；耐藥逆轉(zhuǎn)劑；鱗癌　　0引言口腔癌在世界范圍內(nèi)高發(fā)，居頭頸部腫瘤第二位，是十大最低患者生存率腫瘤之一，原發(fā)多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR)及繼發(fā)MDR較為嚴(yán)重，常見機(jī)制是MDRl、LRP(LungresistancerelatedprotEin,LEP)、MRP1(Mu

3、ltidrugresistancerelatedprotEIn,MRP)表達(dá)升高，導(dǎo)致相應(yīng)胞膜或核膜蛋白表達(dá)增高[1]。如何解決以鱗癌、肝癌等為代表的實(shí)體瘤MDR問題是當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前MDR逆轉(zhuǎn)劑多數(shù)為P糖蛋白（Pgp）功能抑制劑，如維拉帕米（Verapamil,VRP,Ver），臨床上的VRP最大耐受濃度為2μmol/L,這一濃度在體外組織培養(yǎng)中不能逆轉(zhuǎn)MDR，限制了臨床的使用。到目前為止，二、三代多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑（Reuersalagents,RRA）尚未成功應(yīng)用于臨床。因此在天然藥物中尋找高效、低毒RRA或改造已知RRA的化學(xué)結(jié)構(gòu)以降低其毒性是主要研究方向。

4、國(guó)內(nèi)外研究綠茶提取物，特別是EGCG的抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)MDR作用，研究集中于逆轉(zhuǎn)機(jī)制與MDR1或MRP1的關(guān)系，部分結(jié)果表明EGCG可通過抑止Pgp功能發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用，而部分資料顯示其逆轉(zhuǎn)作用獨(dú)立于Pgp和MRP2，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)較缺乏；我們前期已證實(shí)EGCG在體外可逆轉(zhuǎn)人MDR肝癌細(xì)胞BEL7404/ADR的MDR作用[1]。本研究探討EGCG體內(nèi)逆轉(zhuǎn)KBV200的MDR作用，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑和可能的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料和方法　　1.1細(xì)胞與動(dòng)物人口腔表皮樣癌細(xì)胞株KB和KBV200由北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院許佐良教授惠贈(zèng)。BALB/Cnu/nu裸小鼠（

5、4～5周），體重（15±2）g，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)于SPF條件下?！　?.2藥物及試劑鹽酸長(zhǎng)春新堿（VCR）購(gòu)于上海華聯(lián)制藥有限公司；EGCG按專利1060488A分離得；MTT購(gòu)自Sigma，RPMI1640、新生牛血清購(gòu)自GIBCOBRL；抗PgpPE抗體:BectonDickinson；小量組織總RNA快速抽提純化試劑盒購(gòu)自北京華舜；FirststrandcDNAsynthesiskit、MassRulerTMDNALadder購(gòu)自MBI。　　1.3方法　　1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、飽和濕度

6、、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)KBV200培養(yǎng)液中含有200nmol·L-1VCR以維持耐藥性，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代?！　?.3.2耐藥倍數(shù)測(cè)定（MTT法）[2]　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成（2～5）×105ml-1懸液，每孔100μl接種于96孔板，加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)液，參照　　2結(jié)果　　2.1EGCG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響藥物作用后細(xì)胞存活率見表1，作用72hKBV200的IC50為(1.91±0.07)mg/L，KB的IC50為0.036mg/L，KBV200的耐藥倍數(shù)為53倍。30mg/L的EGCG聯(lián)合0.14mg/LVCR處理后，檢測(cè)KBV20

7、0的IC50為(0.14±0.03)mg/L；而0.3mg/L的維拉帕米聯(lián)合不同濃度VCR處理后,KBV200的IC50為(0.45±0.06)mg/L,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為13.0倍和4.3倍，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表1EGCG和VCR對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用(略)　　2.2EGCG對(duì)KB和KBV200細(xì)胞以及對(duì)VCR轉(zhuǎn)運(yùn)的影響在含疊氮鈉的培養(yǎng)條件下，VCR在KB和KBV200細(xì)胞內(nèi)的濃度分別為(25.4±2.1)ng和(25.3±1.7)ng，無顯著差異（P>0.05），EGCG對(duì)VC