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1、蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建張至瑋，李章磊，高飛，曹玉震，夏波林，周宜君（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京１０００８１）摘要：從前期建立的蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中克隆得到１個(gè)編碼ＤＲＥＢ類轉(zhuǎn)錄因子基因。結(jié)果表明，ＡｍＤＲＥＢ２．２基因序列全長１０４５ｂｐ，開放閱讀框（ＯＲＦ）為５９７ｂｐ，編碼１９８個(gè)氨基酸，具有典型的ＤＲＥＢ轉(zhuǎn)錄因子保守的ＡＰ２結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ分析表明，該基因能在根、葉中表達(dá)，但對(duì)干旱、低溫響應(yīng)不同，ＡｍＤＲＥＢ２．２主要參與根的干旱脅迫應(yīng)
2、答。在ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的編碼區(qū)兩端分別加入ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ酶切位點(diǎn)，雙酶切植物表達(dá)載體ｐＰＺＰ２１２和帶有酶切位點(diǎn)的ＡｍＤＲＥＢ２．２基因ＰＣＲ產(chǎn)物，成功獲得了ＡｍＤＲＥＢ２．２的植物過表達(dá)載體ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２。..關(guān)鍵詞：蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］；ＡｍＤＲＥＢ２．２基因；表達(dá)特征；植物表達(dá)載體中圖分類號(hào)：Ｑ７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A：0439－８114（２０15）16－4065-05DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.16.061收稿日期：２０１４－１２－
3、１７基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（３１３７０３５６）；中央民族大學(xué)“９８５工程”學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（ＹＬＤＸ０１０１３）；國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（ＧＣＣＸ２０１４１１００２０）；中央民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（Ｋ２０１４０４４）簡介：張至瑋（１９９３－），女，陜西安康人，在讀本科生，研究方向?yàn)橹参锟鼓娣肿由飳W(xué)，（）１３８０１０４７２２６４（電子信箱）ｚｈｉｗｅｉ＿ｍｕｃ＠１６３．ｃｏｍ；通信，周宜君（１９６４－），女，福建福州人，教授，博士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究，（電子信箱）ｚｈｏｕｙｉｊｕｎ＠ｍｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ。植物中應(yīng)答逆境脅迫的基因通常按照功能分為兩類，一類是功能基
4、因；另一類是調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄因子基因作為調(diào)控基因的一種，可以與真核基因啟動(dòng)子的順式作用元件結(jié)合，從而達(dá)到激活或者抑制轉(zhuǎn)錄的目的［１，２］。目前，已經(jīng)獲得了多種轉(zhuǎn)錄因子基因，將其應(yīng)用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要進(jìn)展［３，４］。其中，對(duì)ＤＲＥＢ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ）轉(zhuǎn)錄因子基因的研究較多［５－７］。ＤＲＥＢ轉(zhuǎn)錄因子屬于ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）家族成員，受干旱、高鹽或低溫誘導(dǎo)表達(dá)，其氨基酸序列的Ｎ末端具有核定位信號(hào)，Ｃ末端具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，而位于中部的Ａ
5、Ｐ２／ＥＲＥＢＰ結(jié)構(gòu)域非常保守，由５８個(gè)氨基酸組成，能形成３個(gè)β－折疊和１個(gè)α－螺旋，兩個(gè)結(jié)構(gòu)都可以結(jié)合到ＤＲＥ元件的核心結(jié)構(gòu)ＰＵＣＣＧＡＣ上［３，８］。研究表明，ＤＲＥＢ２轉(zhuǎn)錄因子基因主要參與調(diào)控植物應(yīng)答干旱、高鹽和熱激脅迫的基因表達(dá)［３，９］。蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］隸屬豆科沙冬青屬，為中亞荒漠中的孑遺植物，具有極強(qiáng)的耐旱、耐低溫、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科學(xué)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值于一身的研究材料。近年來，關(guān)于蒙古沙冬青的抗逆機(jī)理和抗逆基因資源的挖掘受到關(guān)注，并取得了重要研究進(jìn)展［１０－１４］。本研究以蒙古沙冬青為研
6、究材料，基于實(shí)驗(yàn)室前期建立的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫［１０］，克隆獲得１個(gè)新的ＤＲＥＢ類轉(zhuǎn)錄因子基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)和逆境表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步通過異源表達(dá)驗(yàn)證ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。１材料與方法１．１材料１．１．１植物材料蒙古沙冬青種子采自于寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)縣。１．１．２菌株和質(zhì)粒ｐＰＺＰ２１２植物表達(dá)載體由中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司、ｐＧＥＭ－Ｔ載體購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。１．１．３酶和試劑Ｔｒｉｚｏ
7、ｌ試劑購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＦａｓｔＱｕａｎｔｃＤＮＡ第一鏈合成試劑盒和ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ購自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ和限制性內(nèi)切酶均購自Ｔｈｅｒｍｏ公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。１．２方法１．２．１引物設(shè)計(jì)根據(jù)蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中獲得的ＤＲＥＢ相關(guān)基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０設(shè)計(jì)引物，引物Ｐ２．２Ｆ－Ａ：５′－ＧＣＡＡＧ
