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1、第三章基因克隆載體Vectors載體(vector)：在基因工程中，攜帶目的基因或DNA片段進入宿主細胞進行擴增或表達的DNA分子。一、載體的概念作為載體使用的必須是能進入植物寄主細胞內進行復制和表達的核酸分子。二、載體的功能1、運送外源基因高效轉入受體細胞；2、為外源基因提供復制能力或整合能力；3、為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。三、發(fā)展概況1.第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二階段：增大載體容量（降低長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳
2、標記基因。如pUC系列載體。3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。按載體性質分四、分類質粒載體、噬菌體載體和人工染色體目前發(fā)展起來的植物基因轉移的載體系統(tǒng)分為兩大類：一是病毒載體系統(tǒng)二是質粒載體系統(tǒng)※（1）有復制起點※（2）具有若干個限制性內切酶的單一識別位點※（3）具備合適的篩選標記※（4）具備合適的拷貝數目（5）分子量要相對較?。?）在細胞內穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件五、基因工程載體必須具備的條件第一節(jié)質粒載體一、質粒(plasmi
3、d)獨立于細菌染色體外的能獨立復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子細菌中發(fā)現，偶見于鏈霉菌和酵母比病毒還簡單的亞細胞結構，一旦離開寄主細胞則無法繁殖。大腸桿菌的質粒二、質粒的發(fā)現和命名1946年，第一個被發(fā)現的細菌質粒是大腸桿菌的F因子，它的發(fā)現對細菌遺傳學的發(fā)展產生了深遠的影響。1957年，日本學者報道了志賀菌(Shigella)中質粒介導抗生素抗性的轉移現象。（一）質粒的發(fā)現在以后的20多年中，陸續(xù)發(fā)現各種細菌攜帶質粒，且它們的表型特征已遠遠超過了致育性和藥物抗性的范圍。70年代末，隨著遺傳工程的崛起，質粒作為載體己被廣泛應用在遺傳工程和分子生物學的研究中。對很多不同微
4、生物中的質粒進行了基因克隆和生物學功能分析，使質粒的生物學跨入了空前繁榮的研究時期。二、質粒的發(fā)現和命名（一）質粒的發(fā)現（二）質粒的命名原則質粒可以依據其表型效應、大小、復制特性、轉移性或親和性差異劃分為不同的類型。最初發(fā)現的質粒均由研究者根據表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertilityfactor，致育因子)、R質粒(resistancefactor，抗性質粒)和Col質粒(colicin，大腸桿菌毒素質粒)等。隨著研究工作的深入和發(fā)展，愈來愈多的含有質粒的微生物新類群和新質粒被發(fā)現，但由于缺乏統(tǒng)一的命名規(guī)則而導致文獻中質粒名稱的混亂。其規(guī)則是：質粒的名
5、稱一般由三個英文字母及編號組成，第一個字母一律用小寫p表示，后兩個字母應大寫，可以采用發(fā)現者人名、實驗室名稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫。編號為阿拉伯數字，用于區(qū)分屬于同一類型的不同質粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。直至1976年Novick等才提出一個可為質粒研究者普遍接受和遵循的命名原則。（二）質粒的命名原則命名舉例pBR322是最早構建的質粒之一“p”表明它是一個質?！癇R”表示最初構建它的兩個人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez“322”區(qū)別于該實驗室構建的其他質粒，如pBR325、pBR327等三、質粒的基本特性（1）質粒分子
6、較小一般為1-200Kb，最大的可達1400kb(如苜蓿根瘤菌質粒pRm141a)。（2）編碼特性——表型多樣化如抗生素的抗性、產生抗生素、降解復雜有機化合物、產生毒素（如大腸桿菌素、腸毒素）、合成限制性內切酶或修飾酶、生物固氮和殺蟲等。3、質粒的存在形式體外理化因子作用下可形成下列形式開環(huán)DNA分子(oc-DNA)線性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)生理條件下：以共價閉合環(huán)狀DNA分子(Covalentclosecircular,ccc-DNA)形式存在三、質粒的基本特性在變性條件下，質?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。同一質粒盡管分子
7、量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。（4）質粒空間構型與電泳速率三、質粒的基本特性（5）自主復制性攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori）控制質?？截悢档幕蚰塥毩⒂谒拗骷毎娜旧wDNA而自主復制（6）不相容性同一復制系統(tǒng)的不同質粒在同一細菌中不能相容，不同復制系統(tǒng)的質粒在同一細菌中可共存（7）可擴增性質粒就其復制方式而言分為兩類松弛型復制嚴謹型復制（8）可轉移性在天然條件下，大多質?？赏ㄟ^細菌接合作用從一種宿主細胞內轉移到另外一種宿主內。非結合細菌可通過人工方法進行轉化（1）質粒對宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居
