重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達

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1、工程碩士學位論文重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達作者姓名張宏達學科專業(yè)生物工程指導教師王菊芳教授陳超博士所在學院生物科學與工程學院論文提交日期2017年12月ThehighexpressionofrecombinanttrypsinogeninPichiapastorisADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhangHongdaSupervisor：Prof.WangJufangSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou，China分類號：Q819學校代號：10561學號：20

2、1220209307華南理工大學碩士學位論文重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達作者姓名：張宏達指導教師姓名、職稱：王菊芳教授申請學位級別：在職碩士學科專業(yè)名稱：生物工程論文形式?產(chǎn)品研發(fā)?工程設計?應用研究?工程/項目管理?調(diào)研報告研究方向：重組蛋白表達論文提交日期：2017年12月04日論文答辯日期：2017年12月7日學位授予單位：華南理工大學學位授予日期：年月日答辯委員會成員：主席：鄭穗平委員：朱明軍、杜紅麗、梁書利、謝秋玲華南理工大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究所。取得的研究成果除了文中特別加以標注引用的內(nèi)容外，本論文

3、不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢。獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標明本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。１Ｍ年丄：作者簽名：欠釔Ｉ日期月＾日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權單位屬華南理工大學。學校有權保存并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許學位論文被查閱（除在保密期內(nèi)的保密論文外）；學校可以公布學位論文的全部或部分內(nèi)容，可以允許采用影印、縮印或其它復制手段保存、匯編學位一論文。本人電子文

4、檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相致。本學位論文屬于：□保密，在５年解密后適用本授權書＾０不保密意在校園網(wǎng)上發(fā)布，供校內(nèi)師生和與學校有共享協(xié)議的單，同位瀏覽；同意將本人學位論文提交中國學術期刊（光盤版）電子雜志社全文出。版和編入ＣＮＫＩ《中國知識資源總庫》，傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容“”（請在以上相應方內(nèi)打Ｖ＿）作者簽名：欠免忠日期年明３日指導教師簽名：日期：如詐（明ｓ日摘要胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用，它是肽鏈內(nèi)切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶之一，是決定蛋白質(zhì)的氨基酸排

5、列的不可或缺的工具。目前，胰蛋白酶主要有兩種來源，第一種是從動物（豬、牛等）的胰臟中提取得來的，工藝復雜且價格昂貴，較大程度上限制了胰蛋白酶的應用。第二種是使用基因工程重組技術獲得產(chǎn)重組胰蛋白酶的微生物表達系統(tǒng)，經(jīng)過發(fā)酵表達再進行純化提取。本文采用第二種方法，利用基因工程畢赤酵母菌（P.pastoris）進行高密度發(fā)酵工藝高效表達重組胰蛋白酶原。結果表明，胰蛋白酶原的生產(chǎn)水平較高，且激活的胰蛋白酶的酶切特異性與動物胰腺來源的胰蛋白酶相同。相比動物胰腺提取的胰蛋白酶，重組胰蛋白酶具有無外源性病毒污染，不存在其它雜酶的污染，酶切反應的特異性較高，不存在其它副反應等優(yōu)勢。本文旨在探討重組胰蛋白

6、酶原在P.pastoris中的表達，并實質(zhì)性地進行了工業(yè)化生產(chǎn)及應用。本文通過分子克隆獲得胰蛋白酶原基因（參照歐洲專利EP1399568B1）構建重組表達質(zhì)粒，重組表達質(zhì)粒經(jīng)過電轉化進入宿主GS115中進行誘導表達，經(jīng)表達篩選后獲得胰蛋白酶原高產(chǎn)重組工程菌，菌株命名為P.pastorisGS115/pPIC9K-BdP4WB54。其次，本文對該工程菌的形態(tài)、生化特征和遺傳特征進行了研究，并建立了該菌株的主細胞庫(MasterCellBank，MCB)和工作細胞庫(WorkingCellBank，WCB)。通過對該細胞庫的傳代穩(wěn)定性進行了全面的考察，以確定該細胞庫能夠穩(wěn)定傳代并持續(xù)表達目標

7、蛋白。試驗結果表明，該重組胰蛋白酶原工程菌具有典型的P.pastoris形態(tài)和生化特征，且目的基因準確整合到宿主細胞基因組上；經(jīng)過傳代30次后，該工程菌傳代穩(wěn)定，這說明重組基因穩(wěn)定并能持續(xù)穩(wěn)定地表達目標蛋白。再次，本試驗對獲得的工程菌株的發(fā)酵工藝在50L試驗規(guī)模上進行了優(yōu)化，包括：接種時間、接種量、培養(yǎng)基、誘導菌體濃度、誘導pH、誘導溫度、甲醇補加速率、有機氮源補加量、尿素補加速率和發(fā)酵周期等。結果在優(yōu)化后的工藝條件下，取得7.5g