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《細(xì)胞型朊蛋白（prpc）受體或受體源的篩選論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、細(xì)胞型朊蛋白（PrPc）受體或受體源的篩選論文.freelolecule;cerebellargra-nuleneuronsAbstract:AIMToexpress，arebinantproteinPrPAPcontainingtheextracellularpartofprionproteinandalkalinephosphatase（AP）inasecretedformintheculturesuper-natant.andtouseitasaligandtosearchforrecep
2、tors（orbindingproteins）forprionproteinthroughbindingassay.METHODSAPhistochemistryolecules，culturedoligodendrocytesandScharycul-turedcerebellargranuleneurons.TheculturesupernatantcontainingAPongthecelladhesionmoleculesde-tected，onlyNCAM140shobiguouspo
3、sitivebinding，theothermoleculesL1，CHL1，P0，Tag，F(xiàn)3andPrPhadnobindingately20%positivebinding，thebindingrateforoligoden-drocytesaryculturedcerebel-largranuleneuronshadalmost100%cellsbindingaterialforthefurtherseparationofreceptorsforprionprotein.It’simpl
4、iedthatcerebellummighthaveacloserelationshipine（LifeTechnolo-gies，Germany），細(xì)胞培養(yǎng)液成分（LifeTechnolo-gies，Germany），PrP抗體（Charles（120，140，180），P0，PrP（德國漢堡大學(xué)分子神經(jīng)生物研究所提供）;④動(dòng)物:C57BL/6J野生型小鼠（德國漢堡大學(xué)分子神經(jīng)生物研究所動(dòng)物中心提供）.1.2方法①表達(dá)PrPAP和AP:以Lipofec-tamine轉(zhuǎn)染PrPAP質(zhì)粒至293-
5、EBNA細(xì)胞中，48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)培養(yǎng)表達(dá)堿性磷酸酶（AP）的細(xì)胞并收集培養(yǎng)液，以ELISA法檢測(cè)PrP和AP活性;②粘附分子的表達(dá):同樣以Lipofectamine分別將L1，CHL1轉(zhuǎn)染到L929細(xì)胞中，F(xiàn)3，Tag轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，NCAM（120，140，180），P0，PrP至COS-1細(xì)胞中，并且以略去相應(yīng)DNA的模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照;③細(xì)胞系的培養(yǎng):少突膠質(zhì)細(xì)胞系OLN-93以DMEM，100mLL-1FCS，5×103UL-1青霉素和50mgL-1鏈霉素培養(yǎng)液37℃
6、，50molL1CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞80%鋪滿.雪旺氏細(xì)胞系S16以DMEM，100mLL-1FCS，50mgL-1慶大霉素培養(yǎng)液37℃，50molL-1CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞80%鋪滿;④原代小腦顆粒細(xì)胞培養(yǎng):小腦顆粒細(xì)胞培養(yǎng)自6～8d的C57BL/6J野生型小鼠小腦，方法依據(jù)文獻(xiàn)［2］，細(xì)胞重懸和培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)液加1gL-1BSA，2.2gL-1NaH-CO3，100mgL-1Na2CO3，27IUL-1抑肽酶，5IUL-1青霉素，50mgL-1鏈霉素;⑤粘附分子、細(xì)胞系及原代培養(yǎng)細(xì)
7、胞和PrPAP的結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［3］.將細(xì)胞和含PrPAP的細(xì)胞培養(yǎng)液室溫孵育75min，以含AP的細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照，然后依次進(jìn)行洗滌、固定、內(nèi)源性磷酸酶滅活及以NBT/BCIP為底物的堿性磷酸酶的組織化學(xué)反應(yīng).陽性對(duì)照為KitAP及其細(xì)胞表面表達(dá)受體的結(jié)合［4］.2結(jié)果2.1對(duì)所表達(dá)的PrPAP的檢測(cè)經(jīng)PrP抗體和以NBT/BCIP為底物的對(duì)AP活性的ELISA反應(yīng)，表明所收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液含有所需濃度的PrPAP，可用于細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn).2.2粘附分子和朊蛋白結(jié)合僅表達(dá)NCAM140的
8、細(xì)胞與PrPAP有類似陽性的結(jié)合，但經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，仍不能非常確定，為結(jié)論的穩(wěn)妥性，定為陰性.其它分子未見有陽性結(jié)合.2.3細(xì)胞系結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在雪旺氏細(xì)胞中，有部分細(xì)胞顯示陽性結(jié)合，估計(jì)陽性率約20%（Fig1），而少突膠質(zhì)細(xì)胞與朊蛋白呈陽性結(jié)合的細(xì)胞在整個(gè)平皿中約占60%（Fig2），而以表達(dá)AP的培養(yǎng)液所作的對(duì)照，僅有個(gè)別細(xì)胞類似陽性染色（Fig3）.2.4小腦顆粒細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該培養(yǎng)細(xì)胞與朊蛋白有非常好的結(jié)合，有接近100%的陽性率（Fig4），在高倍鏡下可見陽性染色的細(xì)節(jié)，多數(shù)
