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《青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)的研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)的研究論文錢海倫查永喜余江河閻曉菊李廣銀【論文關(guān)鍵詞】氘標記青霉素結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳熒光放射自顯影【論文摘要】當前,細菌耐藥性問題日趨嚴重,給臨床治療帶來困難,對β-內(nèi)酰胺類抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)改變造成的耐藥性,是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs當前，細菌耐藥性問題日趨嚴重，給臨床治療帶來困難，對卜內(nèi)酞胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBps)改變造成的耐藥性，是卜內(nèi)酞胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質(zhì)，是細菌致死
2、的靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與卜內(nèi)酞胺類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜，以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以.freelaSclentifi。，美國);電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide，臨海止學廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產(chǎn)品);N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前進農(nóng)場制劑廠);3H標記青霉素乙酞呱陡鹽(NeX一OmatAR13X18em);2，5一二苯基嗯哇(PPO，閃
3、爍純，上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl，Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs，上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso，北京旭東化工廠)。1.2方法1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，次日再移種新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2~3h至對數(shù)生長期，菌數(shù)約為個/ml(CFU/ml)，菌液分裝試管，每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標記青霉素37℃保溫10min，在冰浴中加入5非標記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml，冷凍離心5000:/minlom仇，棄去上清，菌
4、體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保溫10min使細胞溶解，加入30協(xié)一樣品緩沖液，煮沸3min，置室溫備用。1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm)，凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml，Tris(pH8.8，1.5ml/l)5ml，10%SDS0.2ml，蒸餾水8.1ml，真空攪拌10一15min除去氣體，再加入TE
5、MED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7ml，2.5ml，0.1而，5.6ml，7.5，和150。先配制分離膠，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時維持電壓在60v，至染料前沿到達分離膠和濃縮膠交界處調(diào)高電壓至120v，走完全程約需3一4h，用考馬斯藍R250染色30一45min，過夜脫色。1.2.3關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min，再用新鮮DMSo再次處理30而n，20%即。處理2
6、一3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進行真空干燥，將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內(nèi)，放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Z，閃光燈閃二次;(2)進口x光底片預曝光用x光機最小功率100mA40kV，距離40em，每張x光底片曝光0.04s。1.2.4竟爭性結(jié)合試驗定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min，然后加入飽和量的氛標記青霉素，37℃保溫10min，再按上述方法繼續(xù)進行實驗。2結(jié)果與討論本法測定肺炎鏈球菌全細胞中pBps的含量，首先需要分離
7、菌體蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜(3)，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來，與此同時，已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來。樣品制備完畢，煮沸3min，以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾，青霉素與PBPs結(jié)合較牢固，不會被破壞。本實驗采用SDS一PAGE方法(4-5)，SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。氖標記物穿透
8、力較弱，用一般放射自顯影方法不能得出圖象，本實驗采用熒光放射自顯影法(6-8)(Fluoro，aphy)，檢測聚丙烯酞胺凝膠片上3H標記的蛋白質(zhì)，有一定的優(yōu)點。PPO是熒光增效劑，其作用原理不是直接依賴sH放射出來的日射線，而是藉助3H上的日粒子與PPO相互作用發(fā)射出的光，造成x光底片的局部發(fā)黑得到深淺不同的暗線，從而獲得青霉素結(jié)合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區(qū)帶，即p即;(a，b)，pBpZ
