淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)論文

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1、淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)論文.freelaSclentifi。,美國(guó));電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide,臨海止學(xué)廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產(chǎn)品);N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED,上海前進(jìn)農(nóng)場(chǎng)制劑廠);3H標(biāo)記青霉素乙酞呱陡鹽(NeX一OmatAR13X18em);2,5一二苯基嗯哇(PPO,閃爍純,上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl,Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs,上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso,北京旭東化工廠)。1.2方法1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎

2、鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng),次日再移種新鮮培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)2~3h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌數(shù)約為個(gè)/ml(CFU/ml),菌液分裝試管,每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標(biāo)記青霉素37℃保溫10min,在冰浴中加入5非標(biāo)記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml,冷凍離心5000:/minlom仇,棄去上清,菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液,然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保溫10min使細(xì)胞溶解,加入30協(xié)一樣品緩沖液,煮沸3min,置室溫備用。1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE

3、)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm),凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/l)5ml,10%SDS0.2ml,蒸餾水8.1ml,真空攪拌10一15min除去氣體,再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。先配制分離膠,灌注直立式電泳槽后,使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠,放入加樣梳,靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流,第一小時(shí)維持電壓在60v,至染料前沿到達(dá)分離膠和濃縮膠交界處調(diào)高電壓至12

4、0v,走完全程約需3一4h,用考馬斯藍(lán)R250染色30一45min,過夜脫色。1.2.3關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min,再用新鮮DMSo再次處理30而n,20%即。處理2一3h,l%甘油和1%乙酸處理lh,將凝膠片貼附在厚濾紙上,使用凝膠真空干燥器進(jìn)行真空干燥,將凝膠片和x光底片貼緊,置于x光射線暗匣內(nèi),放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Z,閃光燈閃二次;(2)進(jìn)口x光底片預(yù)曝光用x光機(jī)最小功率100mA40kV,距離40em,每張x光底片曝光0.04s。1.2.4竟?fàn)幮越Y(jié)合試驗(yàn)定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10m

5、in,然后加入飽和量的氛標(biāo)記青霉素,37℃保溫10min,再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果與討論本法測(cè)定肺炎鏈球菌全細(xì)胞中pBps的含量,首先需要分離菌體蛋白,為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上,必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細(xì)胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜,它能選擇性地作用于胞漿膜(3),使胞漿膜破裂,菌體蛋白釋放出來,與此同時(shí),已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來。樣品制備完畢,煮沸3min,以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾,青霉素與PBPs結(jié)合較牢固,不會(huì)被破壞。本實(shí)驗(yàn)采用SDS一PAGE方法(4-5)

6、,SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%。氖標(biāo)記物穿透力較弱,用一般放射自顯影方法不能得出圖象,本實(shí)驗(yàn)采用熒光放射自顯影法(6-8)(Fluoro,aphy),檢測(cè)聚丙烯酞胺凝膠片上3H標(biāo)記的蛋白質(zhì),有一定的優(yōu)點(diǎn)。PPO是熒光增效劑,其作用原理不是直接依賴sH放射出來的日射線,而是藉助3H上的日粒子與PPO相互作用發(fā)射出的光,造成x光底片的局部發(fā)黑得到深淺不同的暗線,從而獲得青霉素結(jié)合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區(qū)帶,即p即;(a,b),pBpZ和pBp3。一般情況下,青霉素濃度越大,親和力越強(qiáng)

7、,顏色越深,在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中,甲氧西林濃度越大,親和力越強(qiáng),顏色越淺。據(jù)報(bào)道(7-9),x光底片預(yù)曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度,.因?yàn)轭A(yù)曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖象吸收值之間的非線性關(guān)系,所以,經(jīng)預(yù)曝光的x光底片上所得到的圖象可以正確反映出樣品的放射性分布情況。用國(guó)產(chǎn)x光底片不經(jīng)預(yù)曝光時(shí),無圖象出現(xiàn),經(jīng)預(yù)曝光則有圖象出現(xiàn)(見圖1),用進(jìn)口x光底片未經(jīng)預(yù)曝光者,圖象的暗線區(qū)別不大(見圖2)。預(yù)曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖象(見圖3)。國(guó)產(chǎn)x光底片與進(jìn)口x光底片比較,國(guó)產(chǎn)片敏感性較低,預(yù)曝后的x光底片上出現(xiàn)的暗線普遍較淺且細(xì),PBPI。

8、不可見。