淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)

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1、淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)【論文關(guān)鍵詞】氘標(biāo)記青霉素結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳熒光放射自顯影【論文摘要】當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來(lái)困難，對(duì)3-內(nèi)酰胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）改變?cè)斐傻哪退幮?，是P-內(nèi)酰胺類抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來(lái)困難，對(duì)卜內(nèi)酞胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白（PBps）改變?cè)斐傻哪退幮?，是卜?nèi)酞胺類抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質(zhì)，是細(xì)菌致死的靶位。它的目、位置、親和力的變化造成與卜內(nèi)酞胺類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們

2、常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研宄PBP譜，以便了解敏感菌和耐藥-H-*的區(qū)別。所以，PBPs測(cè)定技術(shù)是研究壓內(nèi)酸胺類耐藥性的重要手段［1］。的穿透力弱，用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜，需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”國(guó)內(nèi)有關(guān)PBps測(cè)定技術(shù)報(bào)道甚少，以3H標(biāo)記者更少，本文介紹這一技術(shù)。1材料與方法材料菌種肺炎鏈球菌31⑻3,30301（北京藥品生物制品檢定所;本室保存菌種。培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基，參見(jiàn)文獻(xiàn)（2）。僅器及藥品垂直板凝膠電泳槽（吳縣科研儀器廠）；NG—1型真空凝膠干燥器（太倉(cāng)電視機(jī)廠）；TGLL—la型臺(tái)式

3、高速冷凍離心機(jī)（中科院上海生物化學(xué)研究所）；8438—超低溫冰箱（FormaSclentifi。，美國(guó)）；電泳儀DY—1型（上海醫(yī)用分析儀器廠）；丙烯酞胺（Aerylamide，臨海止學(xué)廠產(chǎn)）；甲撐雙丙烯酞胺.（big;瑞士產(chǎn)品）；N，N，N，N一四甲基乙二胺（TEMED,上海前進(jìn)農(nóng)場(chǎng)制劑廠）；3H標(biāo)記青霉素乙酞呱陡鹽（NewEngiandNuclear,美國(guó)）；x光底片（天津感光材料廠;KodakDiangnostiefilmX—OmatARl3X18em）:2,5一二苯基嗯哇（PP0,閃爍純，上海試劑一廠）；月桂酞肌氨酸鈉（Sarkosyl,Sig

4、ma）:十二院基硫酸鈉（SDs,上海新華化工廠）;二甲基亞磯（DMso,北京旭東化工廠）。方法肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日再移種新鮮培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)23h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌數(shù)約為個(gè)/ml（CFU/m1），菌液分裝試管，每管1ml于冰浴中加入不同濃度的氖標(biāo)記青霉素37°C保溫10min,在冰浴中加入5非標(biāo)記青霉素G鈉鹽20萬(wàn)單位/ml，冷凍離心5000:/minlom仇，棄去上清，菌體沉淀用50以磷酸緩沖液0做成菌懸液，然后加入5—10拼一20%sarkosyl,37°C保溫1Omin使細(xì)胞溶解，加入

5、30協(xié)一樣品緩沖液，煮沸3min,置室溫備用。聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚)，凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:),Tris(,/l)5ml,10%SDS,蒸餾水，真空攪拌10—15min除去氣體，再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為，，而，，，和150。先配制分離膠，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次曰加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時(shí)維持電壓在60v，至染料前沿到達(dá)分離膠和濃縮膠交界

6、處調(diào)高電壓至120v，走完全程約需3—4h，用考馬斯藍(lán)R250染色30—45min,過(guò)夜脫色。關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞磯(DMSo)處理30min,再用新鮮DMSo再次處理30而n，20%即。處理2—3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進(jìn)行真空干燥，將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內(nèi)，放超低溫冰箱一70°C使曝光lZwr，將X光底片顯影，定影，沖洗得到TOPS的放射自顯影圖譜。X光底片預(yù)曝光條件：(1)國(guó)產(chǎn)X光底片用照相閃光燈紅色濾光片，加6層紅色玻璃紙濾過(guò)，X光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙，距離5

7、0cm，閃光燈閃二次；(2)進(jìn)口x光底片預(yù)曝光用x光機(jī)最小功率100mA4OkV,距離40em,每張x光底片曝光。竟?fàn)幮越Y(jié)合試驗(yàn)定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37°C10min，然后加入飽和量的氛標(biāo)記青霉素，37°C保溫10min,再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果與討論本法測(cè)定肺炎鏈球菌全細(xì)胞中pBps的含量，首先需要分離菌體蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/mlo肺炎鏈球菌破碎細(xì)胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜(3)，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來(lái)，與

8、此同時(shí)，已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來(lái)。樣品制備完畢，煮沸3min,以便除去某