淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)

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1、淺議青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)【論文關(guān)鍵詞】氘標(biāo)記青霉素結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳熒光放射自顯影【論文摘要】當(dāng)前,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來(lái)困難,對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)改變?cè)斐傻哪退幮?是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs當(dāng)前,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來(lái)困難,對(duì)卜內(nèi)酞胺類(lèi)抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBps)改變?cè)斐傻哪退幮?是卜內(nèi)酞胺類(lèi)抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質(zhì),是細(xì)菌致死的靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的

2、變化造成與卜內(nèi)酞胺類(lèi)抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜,以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以,PBPs測(cè)定技術(shù)是研究壓內(nèi)酸胺類(lèi)耐藥性的重要手段[l]。的穿透力弱,用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜,需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國(guó)內(nèi)有關(guān)PBps測(cè)定技術(shù)報(bào)道甚少,以3H標(biāo)記者更少,本文介紹這一技術(shù)。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種肺炎鏈球菌31003,30301(北京藥品生物制品檢定所;Pen08.R6本室保存菌種。1.1.

3、2培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基,參見(jiàn)文獻(xiàn)(2)。1.1.3僅器及藥品垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠);NG一l型真空凝膠干燥器(太倉(cāng)電視機(jī)廠);TGLL一1a型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(中科院上海生物化學(xué)研究所);8438一超低溫冰箱(FormaSclentifi。,美國(guó));電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide,臨海止學(xué)廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產(chǎn)品);N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED,上海前進(jìn)農(nóng)場(chǎng)制劑廠);3H標(biāo)記青霉素乙酞呱陡鹽(NeX一OmatAR13X18

4、em);2,5一二苯基嗯哇(PPO,閃爍純,上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl,Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs,上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso,北京旭東化工廠)。1.2方法1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng),次日再移種新鮮培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)2~3h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌數(shù)約為個(gè)/ml(CFU/ml),菌液分裝試管,每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標(biāo)記青霉素37℃保溫10min,在冰浴中加入5非標(biāo)記青霉素G鈉鹽20萬(wàn)單位/ml,冷凍離

5、心5000:/minlom仇,棄去上清,菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液,然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保溫10min使細(xì)胞溶解,加入30協(xié)一樣品緩沖液,煮沸3min,置室溫備用。1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm),凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/l)5ml,10%SDS0.2ml,蒸餾水8.1ml

6、,真空攪拌10一15min除去氣體,再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。先配制分離膠,灌注直立式電泳槽后,使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠,放入加樣梳,靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流,第一小時(shí)維持電壓在60v,至染料前沿到達(dá)分離膠和濃縮膠交界處調(diào)高電壓至120v,走完全程約需3一4h,用考馬斯藍(lán)R250染色30一45min,過(guò)夜脫色。1.2.3關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min,

7、再用新鮮DMSo再次處理30而n,20%即。處理2一3h,l%甘油和1%乙酸處理lh,將凝膠片貼附在厚濾紙上,使用凝膠真空干燥器進(jìn)行真空干燥,將凝膠片和x光底片貼緊,置于x光射線暗匣內(nèi),放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Z,閃光燈閃二次;(2)進(jìn)口x光底片預(yù)曝光用x光機(jī)最小功率100mA40kV,距離40em,每張x光底片曝光0.04s。1.2.4竟?fàn)幮越Y(jié)合試驗(yàn)定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min,然后加入飽和量的氛標(biāo)記青霉素,37℃保溫10min,再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果與討論

8、本法測(cè)定肺炎鏈球菌全細(xì)胞中pBps的含量,首先需要分離菌體蛋白,為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上,必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細(xì)胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜,它能選擇性地作用于胞漿膜(3),使胞漿膜破裂,菌體蛋白釋放出來(lái),與此同時(shí),已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來(lái)。樣品制備完畢,煮沸3min,以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾,青霉素與PBPs結(jié)合較牢固,不會(huì)被破壞。本實(shí)驗(yàn)采用SDS