青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)的研究

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1、青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)的研究作者：錢海倫　查永喜　余江河　閻曉菊　李廣銀【論文關(guān)鍵詞】氘標記　青霉素結(jié)合蛋白　聚丙烯酰胺凝膠電泳　熒光放射自顯影【論文摘要】當前,細菌耐藥性問題日趨嚴重,給臨床治療帶來困難,對β-內(nèi)酰胺類抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)改變造成的耐藥性,是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs　　當前，細菌耐藥性問題日趨嚴重，給臨床治療帶來困難，對卜內(nèi)酞胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBps)改變造成的耐藥性，是卜內(nèi)酞胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質(zhì)，是細菌致死的

2、靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與卜內(nèi)酞胺類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜，以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以，PBPs測定技術(shù)是研究壓內(nèi)酸胺類耐藥性的重要手段[l]。的穿透力弱，用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜，需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國內(nèi)有關(guān)PBps測定技術(shù)報道甚少，以3H標記者更少，本文介紹這一技術(shù)。1材料與方法材料菌種肺炎鏈球菌31003，30301(北京藥品生物制品檢定所;本室保存菌種。培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基，參見文獻(2)。

3、僅器及藥品垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠);NG一l型真空凝膠干燥器(太倉電視機廠);TGLL一1a型臺式高速冷凍離心機(中科院上海生物化學研究所);8438一超低溫冰箱(FormaSclentifi。，美國);電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide，臨海止學廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產(chǎn)品);N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前進農(nóng)場制劑廠);3H標記青霉素乙酞呱陡鹽(NewEngiandNuclear，美國);x光底片(天津感光材料廠;KodakDiangnostief

4、ilmX一OmatAR13X18em);2，5一二苯基嗯哇(PPO，閃爍純，上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl，Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs，上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso，北京旭東化工廠)。方法肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，次日再移種新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2~3h至對數(shù)生長期，菌數(shù)約為個/ml(CFU/ml)，菌液分裝試管，每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標記青霉素37℃保溫10min，在冰浴中加入非標記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml，冷凍離心5000:

5、/minlom仇，棄去上清，菌體沉淀用50以磷酸緩沖液()做成菌懸液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保溫10min使細胞溶解，加入30協(xié)一樣品緩沖液，煮沸3min，置室溫備用。聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚)，凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:)，Tris(，/l)5ml，10%SDS，蒸餾水，真空攪拌10一15min除去氣體，再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為，，而，，7.，和150。先配制分離膠

6、，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時維持電壓在60v，至染料前沿到達分離膠和濃縮膠交界處調(diào)高電壓至120v，走完全程約需3一4h，用考馬斯藍R250染色30一45min，過夜脫色。關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min，再用新鮮DMSo再次處理30而n，20%即。處理2一3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進行真空干燥，將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內(nèi)，放超低溫冰箱

7、一70℃使曝光1~Zwr，將x光底片顯影，定影，沖洗得到PBPs的放射自顯影圖譜。x光底片預(yù)曝光條件:(1)國產(chǎn)x光底片用照相閃光燈紅色濾光片，加6層紅色玻璃紙濾過，x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙，距離50cm，閃光燈閃二次;(2)進口x光底片預(yù)曝光用x光機最小功率100mA40kV，距離40em，每張x光底片曝光。竟爭性結(jié)合試驗定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min，然后加入飽和量的氛標記青霉素，37℃保溫10min，再按上述方法繼續(xù)進行實驗。結(jié)果與討論本法測定肺炎鏈球菌全細胞中pBps的含量，首先需要分離菌體

8、蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜(3)，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來，與此同時，已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也