成人脂肪來源干細胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細胞的實驗研究論文

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1、成人脂肪來源干細胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細胞的實驗研究論文梁篤,樊粵光,王海彬魯峰【摘要】【目的】誘導(dǎo)脂肪組織來源干細胞(ADSCs)定向分化為軟骨細胞并進行鑒定，為軟骨組織工程獲取大量種子細胞做準備?！痉椒ā繉颊叱橹g(shù)的脂質(zhì)部分進行分離培養(yǎng)及傳代，采用四氮唑復(fù)合物(MTT)法測定細胞活性并描繪細胞增殖曲線，通過流式細胞儀將培養(yǎng)的細胞行干細胞鑒定，將第4代的ADSCs向軟骨細胞定向誘導(dǎo)分化并行阿新藍染色鑒定;免疫組化檢測成軟骨方向誘導(dǎo)后的ADSCsⅡ型膠原的表達?！窘Y(jié)果】ADSCs體外增殖速度快，并且保持穩(wěn)定的倍

2、增率直至13～15代;流式細胞儀分析提示該細胞具有干細胞特性;通過定向分化技術(shù)，ADSCs可向軟骨細胞分化，阿新藍染色及Ⅱ型膠原表達均呈陽性.freelL。12主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)均由美國Gibco公司提供;Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、四氮唑復(fù)合物(MTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)、吲哚鎂辛、胰島素、二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松均由美國Sigma公司提供;鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體

3、均由美國Zymed公司提供;CO2培養(yǎng)箱(德國SHELLAB公司);離心機(德國Heraus公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);酶標儀(日本Rader公司);BH光學顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);SEM+10%FBS中和酶活性，200μm篩網(wǎng)過濾，1300r/min離心5min，DMEM+10%FBS重懸后，細胞懸液用細胞記數(shù)板記數(shù)，按1×104~2×104接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基,置入37℃、體積分數(shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng),48h換液后每3~4d換液1次。原代

4、細胞培養(yǎng)7～10d即可融合傳代。14細胞傳代棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，以去除血清，加入適量25g/L胰蛋白酶+038g/L乙二胺四乙酸(EDTA)(覆蓋瓶底即可)進行消化，于室溫下消化約1min，在倒置顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)輕柔吹打，將細胞吹打下來，800r/min離心5min，以含體積分數(shù)10%胎牛血清，10g/L青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸沉積細胞，按1∶2的比例進行傳代。當傳代細胞生長接近單層匯合80%時，可繼續(xù)傳代

5、。15MTT法測定細胞活性并描繪細胞增殖曲線8收集第3代ADSCs，接種于96孔板，每孔2×103個細胞，加完全培養(yǎng)基200μL,設(shè)每組4個復(fù)孔。置37℃、體積分數(shù)為5%CO2孵箱培養(yǎng)8d，每天取1組細胞，吸棄上清,每孔加入50μLMTT-PMS工作液(1485mmol/LMTT、5mmol/LPMS,混合比例為200∶1),繼續(xù)培養(yǎng)4h。振蕩5min,以主波長450nm,.freel在酶標儀上比色,測定吸光度D值，取其均值，以時間為橫軸，D值為縱軸繪制出ADSCs生長曲線，并計算細胞倍增時間。16干細胞

6、標記鑒定取培養(yǎng)擴增后第4代的ADSCs，去掉培養(yǎng)液，用1∶1的25g/L的胰蛋白酶和02g/LEDTA混合消化，用含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌后制成含有15×106個ADSCs的單細胞懸液，等分為7份，分別加入7個Eppendorf管中，一號管加入20μL對照試劑，其他試管分別加入CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體各20μL，每管分別加入細胞懸液100μL(1×106個細胞)，室溫孵育25min，用含1%BSA的PBS洗滌后，流式細胞儀檢測。1

7、7成軟骨分化及阿新藍染色定性選擇第4代的ADSCs進行體外成軟骨定向誘導(dǎo)分化。10ng/mLTGF、10mmol/mL地塞米松、50mg/mL維生素C、高糖DMEM配制成軟骨細胞誘導(dǎo)液。以2×104/cm2細胞密度接種于21孔板，細胞接種12h后加入誘導(dǎo)液，每3d換液1次，誘導(dǎo)11d;空白對照組為第3代細胞接種后在含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)時培養(yǎng)孔內(nèi)預(yù)先放置蓋玻片，使細胞貼蓋玻片生長，至11d時取出細胞爬片，阿新藍染色觀察細胞糖胺聚糖分泌情況。倒掉誘導(dǎo)

8、培養(yǎng)ADSCs培養(yǎng)皿中的誘導(dǎo)液，體積分數(shù)10%甲醛固定1h，PBS沖洗15min，蒸餾水沖洗1次，滴加10g/L阿新藍染色，染色3h，加入體積分數(shù)95%乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性樹膠封片。18免疫組化法檢測成軟骨誘導(dǎo)后ADSCsⅡ型膠原表達空白對照孔和誘導(dǎo)孔分別于培養(yǎng)和誘導(dǎo)的7、11、21d取出蓋玻片，10g/L多聚甲醛固定30min，PBS沖洗5min，共3次;體積分數(shù)3%H