成人脂肪來源干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

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1、成人脂肪來源干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究作者：梁篤,樊粵光,王海彬魯峰【摘要】【目的】誘導(dǎo)脂肪組織來源干細(xì)胞(ADSCs)定向分化為軟骨細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，為軟骨組織工程獲取大量種子細(xì)胞做準(zhǔn)備。【方法】對(duì)患者抽脂術(shù)的脂質(zhì)部分進(jìn)行分離培養(yǎng)及傳代，采用四氮唑復(fù)合物(MTT)法測(cè)定細(xì)胞活性并描繪細(xì)胞增殖曲線，通過流式細(xì)胞儀將培養(yǎng)的細(xì)胞行干細(xì)胞鑒定，將第4代的ADSCs向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化并行阿新藍(lán)染色鑒定;免疫組化檢測(cè)成軟骨方向誘導(dǎo)后的ADSCsⅡ型膠原的表達(dá)?！窘Y(jié)果】ADSCs體外增殖速度快，并且保持穩(wěn)定的倍增率直至13～15代;流式細(xì)胞儀分析提示該細(xì)胞具有干細(xì)胞特性;通過定向分化技術(shù)

2、，ADSCs可向軟骨細(xì)胞分化，阿新藍(lán)染色及Ⅱ型膠原表達(dá)均呈陽性，說明定向分化后的細(xì)胞具備正常軟骨細(xì)胞的功能?！窘Y(jié)論】成功誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞定向分化，為軟骨組織工程提供了可靠的種子細(xì)胞。【關(guān)鍵詞】脂肪組織來源干細(xì)胞;軟骨細(xì)胞/病理學(xué);組織工程;細(xì)胞培養(yǎng)軟骨細(xì)胞來源不足一直是制約軟骨組織工程應(yīng)用的重大難題，由于軟骨細(xì)胞取材復(fù)雜，而且難以一次獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量以滿足組織工程的需要，因此探索軟骨細(xì)胞的其他來源具有重要的意義。干細(xì)胞為具有多向分化潛力的細(xì)胞，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)可分化為軟骨細(xì)胞。脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)具有一般干細(xì)胞的特點(diǎn)，而且比其他細(xì)胞有以下優(yōu)勢(shì)：(1)獲取容易;(2)體

3、外增殖速度快，且不必進(jìn)行永生化就能獲得足夠的細(xì)胞用于移植;(3)ADSCs能夠進(jìn)行自體移植，無免疫排斥反應(yīng)等[1-6]。脂肪干細(xì)胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)發(fā)展新療法的機(jī)會(huì)。本研究對(duì)成人ADSCs進(jìn)行了定向誘導(dǎo)分化，現(xiàn)報(bào)道如下。　　1材料與方法　　11組織來源脂肪組織來自于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院整形外科住院病人腹部及大腿脂肪抽脂術(shù)獲得的脂質(zhì)部分,供體無傳染病及內(nèi)分泌疾病,男女不限,抽取前均獲得供體本人同意，并承諾只用于試驗(yàn)研究，平均脂肪抽吸物100mL?！　?2主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)均由美國(guó)Gibco公司提供;Ⅰ

4、型膠原酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、四氮唑復(fù)合物(MTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)、吲哚鎂辛、胰島素、二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松均由美國(guó)Sigma公司提供;鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體均由美國(guó)Zymed公司提供;CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)SHELLAB公司);離心機(jī)(德國(guó)Heraus公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);酶標(biāo)儀(日本Rader公司);BH光學(xué)顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);SEM+10%FBS中和酶活性，200μm篩網(wǎng)過濾，1300r/min離心5min，DMEM+10%FBS重懸后，細(xì)胞懸液用

5、細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，按1×104~2×104接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基,置入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng),48h換液后每3~4d換液1次。原代細(xì)胞培養(yǎng)7～10d即可融合傳代?！　?4細(xì)胞傳代棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，以去除血清，加入適量25g/L胰蛋白酶+038g/L乙二胺四乙酸(EDTA)(覆蓋瓶底即可)進(jìn)行消化，于室溫下消化約1min，在倒置顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)輕柔吹打，將細(xì)胞吹打下來，800r/min離心5min，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，10g/L青、鏈霉素原液的高糖D

6、MEM培養(yǎng)基重懸沉積細(xì)胞，按1∶2的比例進(jìn)行傳代。當(dāng)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層匯合80%時(shí)，可繼續(xù)傳代。　　15MTT法測(cè)定細(xì)胞活性并描繪細(xì)胞增殖曲線[8]收集第3代ADSCs，接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基200μL,設(shè)每組4個(gè)復(fù)孔。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵箱培養(yǎng)8d，每天取1組細(xì)胞，吸棄上清,每孔加入50μLMTT-PMS工作液(1485mmol/LMTT、5mmol/LPMS,混合比例為200∶1),繼續(xù)培養(yǎng)4h。振蕩5min,以主波長(zhǎng)450nm,參比波長(zhǎng)630nm在酶標(biāo)儀上比色,測(cè)定吸光度D值，取其均值，以時(shí)間為橫軸，D值為縱軸繪制出ADSCs生長(zhǎng)曲線，并

7、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間?！　?6干細(xì)胞標(biāo)記鑒定取培養(yǎng)擴(kuò)增后第4代的ADSCs，去掉培養(yǎng)液，用1∶1的25g/L的胰蛋白酶和02g/LEDTA混合消化，用含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌后制成含有15×106個(gè)ADSCs的單細(xì)胞懸液，等分為7份，分別加入7個(gè)Eppendorf管中，一號(hào)管加入20μL對(duì)照試劑，其他試管分別加入CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體各20μ