原位細(xì)胞凋亡檢測改良方法的比較

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1、原位細(xì)胞凋亡檢測改良方法的比較【摘要】目的:探討TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的最佳條件。方法:利用9例標(biāo)本45張組織切片進(jìn)行凋亡檢測，分別單純和組合使用蛋白酶K消化、微波修復(fù)和TritonX100前處理方法并作比較。結(jié)果:蛋白酶K合并微波及TritonX100組（++）陽性率為89%，蛋白酶K合并微波組（++）陽性率為67%，蛋白酶K合并TritonX100組（++）陽性率為44%，單純蛋白酶K及微波組（++）陽性率均為11%。將組合處理組與單純處理組比較，P<0.01，差異有顯著性。結(jié)論:蛋白酶K消化、

2、微波及TritonX100多重組合的檢測前處理方法可以明顯提高雜交信號陽性敏感度?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞凋亡；蛋白酶K；微波　　細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種受基因控制的主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系［1］。原位凋亡檢測是近些年發(fā)展起來的細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)，目前廣泛采用的是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)。凋亡率的高低與患者預(yù)后也有著直接的關(guān)系，現(xiàn)已成為評價(jià)療效的重要指標(biāo)之一［2］。本文應(yīng)用蛋白酶K消化、微波、和Tri

3、tonX100不同的前處理方法，進(jìn)行凋亡檢測的改良和比較，以提高檢測陽性率，正確反映機(jī)體細(xì)胞凋亡的實(shí)際水平。　　1材料與方法　　1.1主要試劑及設(shè)備Roche公司生產(chǎn)的AP原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Cat.NO.11684809910）；微波爐（y，HE染色一張，余作凋亡染色。設(shè)計(jì)蛋白酶K組、微波處理組、蛋白酶合并微波組、蛋白酶合并TritonX100組、蛋白酶合并微波及TritonX100組，每組設(shè)陰性對照2張。　　1.3方法　　1.3.1前處理組織切片脫蠟至水，蒸餾水洗。蛋白酶K組：滴加PBS稀釋的蛋白

4、酶K（20μg/ml），37℃孵育20min，PBS沖洗終止反應(yīng)。微波組：將切片置于200ml0.01MpH6.0枸櫞酸緩沖液中微波處理8min,370pH7.4PBS緩沖液漂洗3次，再滴加堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記的抗熒光素抗體，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，NBT/BCIP避光顯色約10min，鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)，晾干后用水溶性膠（AECGLY）封片。　　1.3.3結(jié)果判定以細(xì)胞核陽性為判定標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合HE染色，對HE染色證實(shí)為壞死的細(xì)胞不記數(shù)。在相同組織切片5個(gè)高倍視野記數(shù)各組間陽性細(xì)胞百分比，

5、凋亡細(xì)胞陽性率<5%為(-),5%～25%(+),25%～50%(++),>50%(+++)?！　?.3.4統(tǒng)計(jì)處理計(jì)數(shù)資料用百分比表示,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件?！　?結(jié)果　　凋亡陽性細(xì)胞核呈深紫褐色，陰性細(xì)胞核不著色（見圖1～圖4）。各組切片比較，以蛋白酶K合并微波處理及TritonX100組陽性敏感度最高，蛋白酶K合并微波組次之，單純蛋白酶K及微波組最低。各組陽性細(xì)胞敏感度百分比見表1，差異有顯著性意義（P<0.01）?！　”?不同的前處理方法凋亡檢測陽性敏感度比較（

6、略）　　注：A組與B組或C組比較，P<0.01?！　D1A組APTUNEL200（略）　　圖2B組APTUNEL200（略）　　圖3C組APTUNEL200（略）　　圖4D組APTUNEL200（略）　　3討論　　TUNEL技術(shù)作為一種比較成熟的凋亡細(xì)胞染色方法已被廣泛采用,但如何提高染色的特異性和敏感性還存在一些問題。應(yīng)用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡時(shí)，染色的結(jié)果常常受到多因素的影響,如組織的自溶、固定劑的類型、固定包埋時(shí)造成的DNA損傷,染色過程中試劑的濃度、作用的時(shí)間等均是影響染色成敗的關(guān)鍵。目前

7、的凋亡檢測多采用蛋白酶K或胰蛋白酶等單一的前處理方法，對于石蠟標(biāo)本的染色陽性度和敏感度普遍不高,容易出現(xiàn)假陽性和假陰性,因此，在進(jìn)行組織切片的原位檢測時(shí)，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理是必要的［3］，可以提高該方法的敏感性和消除假陽性及非特異性染色，但試劑說明及