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《不可忽視的細部分血液基因組提取》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、不可忽視的細節(jié)—血液基因組提取天根生化科技（北京）有限公司DNA提取的原則基因組提取方法樣本保存和前處理基因組提取流程DNA保存及檢測方法試劑選擇原則內(nèi)容沒有嚴格要求:PCRSouthernBlotsRFLP嚴格要求片段長度:構(gòu)建文庫PFGE(脈沖場凝膠電泳)DNALengthDNA提取原則1：DNA片段長度沒有嚴格要求常規(guī)PCR嚴格要求產(chǎn)物純度存檔、產(chǎn)物長期保存Southern雜交熒光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比較基因組雜交)DNA提取原則2：DNA產(chǎn)物純度DNA提取的原則基因組提取方
2、法樣本保存和前處理基因組提取流程DNA保存及檢測方法試劑選擇原則內(nèi)容基因組提取方法溶液鹽析法：無需酚氯仿，樣本量靈活可變，得率高硅膠膜吸附法：利用硅膠膜特異吸附核酸的原理來純化核酸磁珠法：獨特包埋的磁珠，在一定條件下對核酸具有很強的親和力，而當條件改變時，磁珠釋放吸附的核酸，能夠達到快速分離純化核酸的目的。傳統(tǒng)酚氯仿法：傳統(tǒng)方法，抽提時間長，成本低。但酚氯仿有毒，危害身體健康。DNA提取的原則基因組提取方法樣本保存和前處理基因組提取流程DNA保存及檢測方法試劑選擇原則內(nèi)容樣本保存和前處理－抗凝血液保存檸檬
3、酸、EDTA、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對酶反應(yīng)有可能起阻害作用,采血時如沒有特殊要求,請使用檸檬酸或EDTA處理血樣。 加入抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個月；－70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理1.凍存的抗凝血液使用前溶解應(yīng)在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要徹底混勻后再吸取實驗所需的體積。樣本保存和前處理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝塊。-20℃保存一個月；-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理1.凍存的血凝塊使用前應(yīng)在37℃水浴溶解，
4、輕柔顛倒混勻。2.血凝塊取出后先采取機械破碎的方法（例如：放入無粉橡膠手套中捏碎或勻漿）將血凝塊破碎，然后再根據(jù)自己的實驗取適量樣本。血凝塊前期破碎程度越高，提取基因組就越容易！樣本保存和前處理－白膜層保存全血分離得到的白膜層放置-20℃或-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理1.白膜層是將全血離心取中間層所得。白細胞則是用紅細胞裂解液裂解紅細胞后得到的沉淀。2.凍存的白膜層使用前應(yīng)在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。3.雖然得到的是白膜層，但是會有少量紅細胞存在，所以紅細胞裂解液還是必要
5、的，但用量減半。4.采用白膜層提取核酸時，所用到的提取溶液體積需按照全血體積進行操作。即：1ml全血得到的白膜層提取時需要加入提取1ml全血的試劑量。樣本保存和前處理－血清/血漿保存現(xiàn)在很多科研者使用血清/血漿提取游離核酸進行研究，例如：腫瘤研究。分離得到的血清/血漿放置-70℃保存。盡量避免樣本反復(fù)凍融。樣本前處理1.凍存的血清/血漿使用前溶解應(yīng)在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。2.血清/血漿核酸提取時無需紅細胞裂解。3.只需100-200ul樣本，基本能滿足下游常規(guī)PCR或熒光定量PCR檢測。樣本保存和
6、前處理－微量血液/干血點/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存； 干血點：干燥后室溫或4℃保存； 羊水：-20或-70℃保存。樣本前處理1.微量血液處理同抗凝血液，不同之處是無需進行紅細胞裂解步驟。2.干血點加入緩沖液直接進行提取。3.羊水/胸水提取時先離心得到沉淀，再進行裂解提取核酸。樣本保存和前處理－口拭子/漱口水保存口拭子：干燥后室溫保存 漱口水：4℃保存或離心得到沉淀-20℃或-70℃保存樣本前處理1.拭子將拭子棉頭剪入到離心管里，加入緩沖液直接進行提取。2.有些拭子的棉頭剪不下來
7、，可以將拭子在生理鹽水里漂洗幾次，離心得到沉淀再進行核酸提取。3.漱口水先進行離心得到沉淀再進行核酸提取。DNA提取的原則基因組提取方法樣本保存和前處理基因組提取流程DNA保存及檢測方法試劑選擇原則內(nèi)容基因組提取流程加入吸附柱緩沖液漂洗DNA洗脫收集樣本裂解純化去蛋白沉淀核酸洗滌去鹽溶解DNA沉淀樣本裂解溶液法（鹽析法）吸附柱法紅細胞裂解哺乳動物血液的紅細胞中沒有細胞核且核酸酶含量豐富，所以裂解紅細胞對核酸提取非常重要。紅細胞裂解有兩種方式：采用紅細胞裂解液進行裂解（通常紅細胞裂解液按照3倍全血體積加入進
8、行裂解).采用細胞裂解液進行裂解（TIANGEN的細胞裂解液CL是按照2.5倍全血體積），細胞裂解液將紅細胞裂解的同時可以裂解白細胞，得到的為細胞核沉淀，更方便基因組DNA的提取。紅細胞裂解充分的現(xiàn)象： 得到的沉淀應(yīng)為白色沉淀或淡粉色沉淀。有時血液需要進行兩次裂解，注意第二次加入裂解液后需要將沉淀votex徹底混勻。核細胞裂解如果有裂紅的步驟，請盡量將上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN試劑盒中的GB或FG）和
