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《大腸桿菌r基因克隆載體地構(gòu)建與鑒定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案大腸桿菌R基因克隆載體的構(gòu)建與鑒定[摘要]DNA的重組與轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作。本實(shí)驗(yàn)可分為質(zhì)粒DNA提取與鑒定，目的片段擴(kuò)增與鑒定，DNA重組與轉(zhuǎn)化三部分。本次實(shí)驗(yàn)可以全面提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能與邏輯思維，對于分子實(shí)驗(yàn)技能的培養(yǎng)具有重要意義。[關(guān)鍵詞]DNA重組；轉(zhuǎn)化；分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸埃希氏菌是常用的實(shí)驗(yàn)菌種，其質(zhì)粒R-pGEX-4T-1為人工設(shè)計，已加入R目的基因片段?，F(xiàn)需要將R基因轉(zhuǎn)到pMD18-TSimpleVector載體質(zhì)粒上，并將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化效率。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株及質(zhì)
2、粒E.coliDH5α；R-pGEX-4T-1質(zhì)粒；pMD18-T載體。1.1.2主要試劑和儀器溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，TE緩沖液，0.5MEDTA，5*TBE，氯仿:異戊醇（V:V，24:1），70%乙醇，50mg/mLCarb，10*loading-buffer，2.5mmol/LdNTP混合物，Taq酶，DNA模板，引物對，10*PCRbuffer，50*TAE，0.1MCaCl2溶液，LB固體/液體培養(yǎng)基，5mg/mlTet，34mg/mlCam，3MNaAC，10mg/mLX-gal，200mg/mLIPTG（以上常規(guī)試劑全部按照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
3、指導(dǎo)》要求配制）；恒溫?fù)u床，臺式離心機(jī)，高壓滅菌鍋，凝膠成像儀，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，PCR熱循環(huán)儀，低溫離心機(jī)，超凈工作臺。1.2方法1.2.1質(zhì)粒DNA提取向含Carb（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中接入含R-pGEX-4T-1質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒DNA用堿裂解法制備，具體步驟參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。用1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證質(zhì)粒提取結(jié)果。1.2.2質(zhì)粒DNA雙酶切及鑒定運(yùn)用XhoⅠ酶與EcoRⅠ酶對上述步驟中提取的質(zhì)粒R-pGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系參見表1（如下），37℃反應(yīng)1.5小時。并用1％瓊脂糖凝膠電泳
4、驗(yàn)證酶切結(jié)果。1.2.3目的DNA片段的擴(kuò)增與純化精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案根據(jù)質(zhì)粒R-pGEX-4T-1的序列，設(shè)計一對R基因引物（表2）用于R基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系以質(zhì)粒DNA為模板，用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增（表3），反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40sec，55℃退火50sec，72℃延伸50sec，重復(fù)30個循環(huán)，72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳圖像分析鑒定,并按照膠回收試劑盒步驟，割膠純化，回收PCR產(chǎn)物，-20℃低溫保存。表1酶切反應(yīng)體系表3PCR反應(yīng)體系表2擴(kuò)增R基因所用引物1.2.4DNA重組與轉(zhuǎn)化用CaCl2處理大
5、腸桿菌，制備感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。按照表4構(gòu)建連接重組體系，16℃連接反應(yīng)30min，制備重組質(zhì)粒。將5μL連接產(chǎn)物加入至200μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min；熱激，恢復(fù)性培養(yǎng)后去上清涂布于含有X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基，倒置平皿37℃培養(yǎng)過夜（12～16h），形成單菌落，計數(shù)白色、藍(lán)色菌落。表4質(zhì)粒連接重組體系pMD18-TSimpleVector（50ng/μL）0.5μLInsertDNA（0.1pmol～0.3pmol）3μLddH2Oupto5μLLigationMix5μL總體積10
6、μL2結(jié)果2.1質(zhì)粒DNA提取結(jié)果鑒定2.1.1質(zhì)粒提取后，1％瓊脂糖凝膠電泳。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖缺失）精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案2.1.2質(zhì)粒雙酶切二次鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳（如圖一）顯示出特異性條帶說明質(zhì)粒中確含有R基因，質(zhì)粒提取成功。M：DL2000maker；1：雙酶切結(jié)果產(chǎn)物M：DL2000maker；1：R基因PCR產(chǎn)物圖一質(zhì)粒R-pGEX-4T-1雙酶切鑒定結(jié)果圖2R基因PCR鑒定結(jié)果2.2目的DNA片段的擴(kuò)增鑒定用所設(shè)計的引物對目的片段R基因進(jìn)行克隆，得到R基因（600bp）（如圖二）條帶清晰、亮度高，證明PCR結(jié)果較為理想。2.3DNA轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定
7、本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成功，培養(yǎng)基表面涂花，無單菌落長出。3討論細(xì)菌質(zhì)粒的獲取，與DNA重組與轉(zhuǎn)化，是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作。在本次實(shí)驗(yàn)中。成功實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA的提取與鑒定，目的基因的克隆與鑒定，細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞制備與質(zhì)粒DNA重組與轉(zhuǎn)化。在實(shí)驗(yàn)中，也有操作不理想之處。分析DNA轉(zhuǎn)化鑒定沒有結(jié)果的原因，有以下幾點(diǎn)：Amp可能加入過早，未待平板冷卻，導(dǎo)致加入的Amp失活，故沒有Amp抗性的培養(yǎng)基上長滿了菌，而不出現(xiàn)白色的單菌落；燒熱的涂棒未冷卻便進(jìn)行菌液涂布，導(dǎo)致培養(yǎng)基表面融化；菌液未充分混勻，平板菌落分布不均等。[參考文獻(xiàn)][1]魏群，2007.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指
8、導(dǎo).高等教育出版社.75—96[2]高小煥，邵世和，段秀杰，謝立蘋
