基因工程-32大腸桿菌克隆載體

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1、第三章第二部分大腸桿菌的克隆載體CloningVectorsforE.coli所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。因為：過去50年內(nèi)，這種細菌在基礎研究中一直扮演著中心角色；已積累大量有關大腸桿菌的微生物學、生物化學和遺傳學知識；事實上所有關于基因結構和功能的基礎研究都是以大腸桿菌為材料而開展的。3.1基于大腸桿菌質(zhì)粒的克隆載體基因克隆領域最得到廣泛應用的也是最簡單的，是那些以大腸桿菌質(zhì)粒為基礎而構建的克隆載體?？捎糜诖竽c桿菌的有很多不同的質(zhì)粒載體，其中有很大一部分是由商業(yè)公司提供的。他們開發(fā)

2、的載體既易于純化，又結合一些想要的特性，如高的轉化效率、方便的轉化和重組的篩選標志以及克隆相當大的DNA片段(高達8kb)的能力。如：pBR322。pBR322是最早被構建的質(zhì)粒，至今仍被廣泛使用。3.1.1質(zhì)?？寺≥d體的命名法“pBR322”這個名字符合載體命名法的標準規(guī)則：“p”說明它是一個質(zhì)粒；“BR"表示最初構建它的實驗室(BR代表了兩個構建人的名字：Bolivar和Rodriguez)?！?22"把該質(zhì)粒和該實驗室構建的其他質(zhì)粒區(qū)分開來(另外還有pBR325，pBR327，pBR3283.1.2

3、pBR322的一些有用特性從pBR322的遺傳圖譜和物理圖譜(圖6-1)可以看出為什么它能是一個如此受歡迎的克隆載體？第一個優(yōu)點在于它的大小第2章里提到，作為一個克隆載體它的大小應該小于10kb，否則在提純它的時候很容易導致DNA斷裂。pBR322只有4363bp，意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNA分子。即使添加上6kb的DNA鏈，重組的pBR322的大小仍在可操作的范圍內(nèi)。第二個優(yōu)點是擁有兩套抗生素耐藥性基因兩個耐藥性基因(氨芐青霉素耐藥性和四環(huán)素耐藥性基因)都可作為含有該質(zhì)粒的篩選標志

4、，而且每個抗性基因內(nèi)都擁有一個限制性單酶切位點，這在克隆實驗中非常有用。用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA會導致氨芐青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ等8個限制性內(nèi)切核酸酶酶切后插入DNA會導致四環(huán)素抗性基因失活。這意味著pBR322支持很多種不同黏性末端的DNA片段的導入。第三個優(yōu)點在于pBR322有相當高的拷貝數(shù)通常在被轉化過的大腸桿菌中有大約15個pBR322質(zhì)粒分子；在蛋白質(zhì)合成抑制劑(如氯霉素)的存在下，通過質(zhì)粒擴增，拷貝數(shù)可以增加到1000-3000。這樣，通過培養(yǎng)大腸桿

5、菌就可以獲得大量重組過的pBR322質(zhì)粒分子。3.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克隆載體的方便性決非偶然，它在被設計時就定好了要擁有這些特點。構建pBR322的步驟簡述如圖。它的構建是一件曲折而艱巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技術。pBR322實際上由3個在自然界存在的天然質(zhì)粒拼接而成。3.1.4其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是在20世紀70年代后期被構建出來的，第一份描述它的用途的論文在1977發(fā)表。從那以后，人們構建了大量其他的質(zhì)?？寺≥d體，它們大多數(shù)只是對pBR322作了

6、少量修改。pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR322中移除一個長1089bp的片段而構建。片段的刪除并沒有損傷ampR和terR這兩個抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復制能力和接合能力。pBR327與pBR322有兩點重要的不同(1)pBR327的拷貝數(shù)比pBR322更高。每個大腸桿菌中可以存在30-45個質(zhì)粒分子。當實驗的目標是研究被克隆的基因功能的時候，有更高拷貝數(shù)的pBR327就更適合于用作載體。拷貝數(shù)越高，被克隆的基因在細胞中所產(chǎn)生的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。(2)1089bp片段的刪除，破壞

7、了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己轉移到另外一個大腸桿菌細胞中去。這一點對生物防范很重要，避免了粗心的生物學家使重組后的質(zhì)粒從試管和細菌植株中逸出。相反，pBR322在理論上可以通過結合而進入天然的大腸桿菌細胞中去，雖然事實上pBR322也有一定的安全措施減少這種情況的發(fā)生。當被克隆的基因有潛在的危害性時，應優(yōu)先選擇pBR327。pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)粒，只保留了pBR322的復制起點和ampR基因。ampR基因的核酸序列也被改變了，不再包含唯一的限制

8、性酶切位點。所有這些位點被集中到pUC8所攜帶的lacZ'基因中的一小段序列上。pUC8所擁有的3個優(yōu)點使它成為最受歡迎的大腸桿菌克隆載體之一。第一個優(yōu)點人們在構建這個質(zhì)粒時，在它的復制起點上產(chǎn)生了一個偶然的突變，使得它在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)達到了500-700（擴增以前的數(shù)目）。這樣可以在轉化后的大腸桿菌細胞中獲得大量的目的DNA。第二個優(yōu)點在于重組體的識別只需一步，僅僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐青霉素和X-gal的