基因操作與克隆載體

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1、DNA的損傷原因：1.DNA分子的自發(fā)性損傷(1)DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤(2)DNA的自發(fā)性化學(xué)變化a.堿基的異構(gòu)互變b.堿基的脫氨基作用c.脫嘌呤與脫嘧啶d.堿基修飾與鏈斷裂2.物理因素引起的DNA損傷(1)紫外線引起的DNA損傷(2)電離輻射引起的DNA損傷a.堿基變化b.脫氧核糖變化、c.DNA鏈斷裂d.交聯(lián)復(fù)習(xí)3.化學(xué)因素引起的DNA損傷(1)烷化劑對DNA的損傷a.堿基烷基化b.堿基脫落c.斷鏈d.交聯(lián)(2)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷復(fù)習(xí)分子改變類型：點(diǎn)突變(pointmutation)：指DNA分子上一個(gè)堿基的變異（置換）。(1)、轉(zhuǎn)換(transition)：發(fā)生在同

2、型堿基之間的置換(2)、顛換(transversion)：發(fā)生在異型堿基之間的置換突變效應(yīng)：同義突變錯(cuò)義突變無義突變終止密碼突變抑制基因突變移碼突變DNA的修復(fù)系統(tǒng)(一)回復(fù)修復(fù)1.光修復(fù)2.單鏈斷裂的重接3.堿基的直接插入4.烷基的轉(zhuǎn)移(二)切除修復(fù)(excisionrepair)(三)重組修復(fù)(recombinationalrepair)(四)SOS修復(fù)復(fù)習(xí)1．轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征a.簡單轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。最簡單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertionsequence，IS），它們

3、是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個(gè)IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。b.復(fù)合式轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨(dú)移動(dòng)，因?yàn)樗鼈兊墓δ鼙恍揎椓耍荒茏鳛閺?fù)合體移動(dòng)。重組與轉(zhuǎn)座2、轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp

4、）、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同，但對于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。重組與轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用3.反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(ret

5、rotransposon或retroposon)指通過RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可動(dòng)元件。這樣的轉(zhuǎn)座過程稱為反轉(zhuǎn)座作用(retrotrans—position)。4.轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)①轉(zhuǎn)座引起插入突變;②轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因;③轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變;④轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.目前轉(zhuǎn)座子元件是植物分子生物學(xué)操作和植物基因工程中分離克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大類—反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有分布廣、異源轉(zhuǎn)座高和受組織培養(yǎng)誘導(dǎo)激活等優(yōu)勢。此外通過對現(xiàn)有轉(zhuǎn)座元件的改造以及轉(zhuǎn)座元件作為載體改造的工具，也將大大加速植物基因和功能序列的分離與研究，如利用轉(zhuǎn)座子元件構(gòu)建啟動(dòng)子。二

6、、限制性內(nèi)切酶1、限制性內(nèi)切酶的定義?是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分，具有識別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶。2、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)?Luria和Human發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來的DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制修飾。二、限制性內(nèi)切酶Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶被命名為HindI,這是第一個(gè)分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。二、限制性內(nèi)切酶二、限制性內(nèi)切酶3、限制性核酸內(nèi)切

7、酶的命名?按酶來源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。二、限制性內(nèi)切酶4、限制性內(nèi)切酶的類型限制性內(nèi)切酶可分為三大類型：?類型I和類型III：由于識別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。?類型II：是DNA重組技術(shù)最