基因工程-3.2大腸桿菌克隆載體

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1、第三章第二部分大腸桿菌的克隆載體CloningVectorsforE.coli所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。因?yàn)椋哼^去50年內(nèi)，這種細(xì)菌在基礎(chǔ)研究中一直扮演著中心角色；已積累大量有關(guān)大腸桿菌的微生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識；事實(shí)上所有關(guān)于基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究都是以大腸桿菌為材料而開展的。3.1基于大腸桿菌質(zhì)粒的克隆載體基因克隆領(lǐng)域最得到廣泛應(yīng)用的也是最簡單的，是那些以大腸桿菌質(zhì)粒為基礎(chǔ)而構(gòu)建的克隆載體。可用于大腸桿菌的有很多不同的質(zhì)粒載體，其中有很大一部分是由商業(yè)公司提供的。他們開發(fā)的載體既易于純化，又結(jié)合

2、一些想要的特性，如高的轉(zhuǎn)化效率、方便的轉(zhuǎn)化和重組的篩選標(biāo)志以及克隆相當(dāng)大的DNA片段(高達(dá)8kb)的能力。如：pBR322。pBR322是最早被構(gòu)建的質(zhì)粒，至今仍被廣泛使用。3.1.1質(zhì)?？寺≥d體的命名法“pBR322”這個名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：“p”說明它是一個質(zhì)粒；“BR"表示最初構(gòu)建它的實(shí)驗(yàn)室(BR代表了兩個構(gòu)建人的名字：Bolivar和Rodriguez)?！?22"把該質(zhì)粒和該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開來(另外還有pBR325，pBR327，pBR3283.1.2pBR322的一些有用特性從pBR322的遺傳圖

3、譜和物理圖譜(圖6-1)可以看出為什么它能是一個如此受歡迎的克隆載體？第一個優(yōu)點(diǎn)在于它的大小第2章里提到，作為一個克隆載體它的大小應(yīng)該小于10kb，否則在提純它的時候很容易導(dǎo)致DNA斷裂。pBR322只有4363bp，意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNA分子。即使添加上6kb的DNA鏈，重組的pBR322的大小仍在可操作的范圍內(nèi)。第二個優(yōu)點(diǎn)是擁有兩套抗生素耐藥性基因兩個耐藥性基因(氨芐青霉素耐藥性和四環(huán)素耐藥性基因)都可作為含有該質(zhì)粒的篩選標(biāo)志，而且每個抗性基因內(nèi)都擁有一個限制性單酶切位點(diǎn)，這在克隆實(shí)驗(yàn)中非常有用。

4、用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA會導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ等8個限制性內(nèi)切核酸酶酶切后插入DNA會導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活。這意味著pBR322支持很多種不同黏性末端的DNA片段的導(dǎo)入。第三個優(yōu)點(diǎn)在于pBR322有相當(dāng)高的拷貝數(shù)通常在被轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌中有大約15個pBR322質(zhì)粒分子；在蛋白質(zhì)合成抑制劑(如氯霉素)的存在下，通過質(zhì)粒擴(kuò)增，拷貝數(shù)可以增加到1000-3000。這樣，通過培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過的pBR322質(zhì)粒分子。3.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克

5、隆載體的方便性決非偶然，它在被設(shè)計時就定好了要擁有這些特點(diǎn)。構(gòu)建pBR322的步驟簡述如圖。它的構(gòu)建是一件曲折而艱巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技術(shù)。pBR322實(shí)際上由3個在自然界存在的天然質(zhì)粒拼接而成。3.1.4其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是在20世紀(jì)70年代后期被構(gòu)建出來的，第一份描述它的用途的論文在1977發(fā)表。從那以后，人們構(gòu)建了大量其他的質(zhì)?？寺≥d體，它們大多數(shù)只是對pBR322作了少量修改。pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR322中移除一個長1089bp的片段而構(gòu)建。片段的刪除并

6、沒有損傷ampR和terR這兩個抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復(fù)制能力和接合能力。pBR327與pBR322有兩點(diǎn)重要的不同(1)pBR327的拷貝數(shù)比pBR322更高。每個大腸桿菌中可以存在30-45個質(zhì)粒分子。當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究被克隆的基因功能的時候，有更高拷貝數(shù)的pBR327就更適合于用作載體?？截悢?shù)越高，被克隆的基因在細(xì)胞中所產(chǎn)生的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。(2)1089bp片段的刪除，破壞了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己轉(zhuǎn)移到另外一個大腸桿菌細(xì)胞中去。這一點(diǎn)對生物防范很重要，避免了粗心的生物學(xué)家使重組后的質(zhì)粒從試

7、管和細(xì)菌植株中逸出。相反，pBR322在理論上可以通過結(jié)合而進(jìn)入天然的大腸桿菌細(xì)胞中去，雖然事實(shí)上pBR322也有一定的安全措施減少這種情況的發(fā)生。當(dāng)被克隆的基因有潛在的危害性時，應(yīng)優(yōu)先選擇pBR327。pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)粒，只保留了pBR322的復(fù)制起點(diǎn)和ampR基因。ampR基因的核酸序列也被改變了，不再包含唯一的限制性酶切位點(diǎn)。所有這些位點(diǎn)被集中到pUC8所攜帶的lacZ'基因中的一小段序列上。pUC8所擁有的3個優(yōu)點(diǎn)使它成為最受歡迎的大腸桿菌克隆載體之一。第一個優(yōu)點(diǎn)人們在構(gòu)建這個

8、質(zhì)粒時，在它的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生了一個偶然的突變，使得它在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)達(dá)到了500-700（擴(kuò)增以前的數(shù)目）。這樣可以在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中獲得大量的目的DNA。第二個優(yōu)點(diǎn)在于重組體的識別只需一步，僅僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐青霉素和X-gal的