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《櫛孔扇貝血細胞形態(tài)學(xué)研究和抗病功能基因的克隆研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文櫛孔扇貝血細胞形態(tài)學(xué)研究和抗病功能基因的克隆姓名：馬洪明申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖指導(dǎo)教師：麥康森20040609{§甜。扇9l】R嘲l(fā)胞形態(tài)學(xué)塒究和抗捐功能堆㈥的克降櫛孔扇貝血細胞形態(tài)學(xué)研究和抗病功能基因的克隆捅姜櫛孑L扇貝(Chlamys／a，Mrf)是我國北方重要的海水養(yǎng)殖種類。近年來頻發(fā)的病害和大規(guī)模死亡給櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。貝類的免疫防御手要依靠血細胞的吞噬作用和血淋巴中各種非特異的免疫活性因子的識別、調(diào)節(jié)和殺傷等作_}_}j。大多數(shù)學(xué)者將雙殼貝類的血細胞分
2、為兩類：粒細胞和透明細胞。在一些種類也發(fā)現(xiàn)三種以上的血細胞。貝類體液中的非特異免疫防御因予目前發(fā)現(xiàn)的包括調(diào)理素、抗菌肽、類細胞因子樣物質(zhì)等。由于貝類沒有基于淋巴細胞和抗體的獲得性免疫機制，血細胞和非特異的體液因予構(gòu)成了貝類抵抗病害感染的主要防線。本文研究了櫛孔扇貝血細胞的形態(tài)，并嘗試對體液免疫活性因子基因進行了克隆和篩選。利用顯微鏡學(xué)和流式細胞術(shù)對櫛孔扇貝血細胞進行r形態(tài)學(xué)研究和分類。趣微結(jié)構(gòu)觀察顯示有三種不同形態(tài)的細胞：I型血細胞含有發(fā)達的細胞器如線粒體、高爾基體和粗l前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，特別是細胞質(zhì)中含有大量的囊泡
3、結(jié)構(gòu)，細胞器和囊泡結(jié)構(gòu)向核區(qū)聚集，形成明顯的內(nèi)質(zhì)和外質(zhì)：II型細胞含較少的細胞器和囊泡結(jié)構(gòu)，較為電子透明，細胞器和囊泡在細胞中均勻分布；III型血細胞具有較小的胞體和較大的細胞核，核質(zhì)比高，幾乎不含囊泡和細胞器。沒有發(fā)現(xiàn)在其他雙殼貝類中被廣泛報道的粒細胞。注射酵母刺激后，I型血細胞的數(shù)目顯著增加，細胞質(zhì)變得更加電子致密；II型細胞的囊泡和細胞器亦有輕微增加；T1I型細胞未見顯著變化。流式細胞術(shù)(FSCvSSC)顯示蘭群細胞被清楚地分開：1)顆粒度高的大細胞，2)中等顆粒度的中等大小細胞，3)顆粒度低的小細胞。
4、m淋巴中的平均血細胞數(shù)為203二E0．43×107ml／1，三群細胞分別占58O％，24．1％，17．9％。在玻片上充分伸展后，Ifli細胞同樣顯山3種不同的伸展樣式：分別命名為A，B，C型。A型Ⅱ口細胞折光性強，明亮：片狀偽足伸展明顯，且多從細胞之一端伸出。B型細胞折光性差，較暗；偽足刺突樣。C型血細胞較暗，沒有明顯的伸展。伸展特征、電鏡觀察和流式細胞術(shù)分析的結(jié)果互相吻合，據(jù)此，可將櫛孔扇貝的血細胞分為櫛孔扇弛jf}l自11月縋蟛怠學(xué)磷究和抗瘸功能揍俐的兜酶三類。q2-巨球蛋白(0．2．Macroglobu
5、lin，02M)是存在于多種動物血漿中的‘類大分子糖蛋白，足重要的非特異免疫因子。作為廣譜蛋白酶抑制因子，ct2M通過結(jié)合并抑制組織中內(nèi)源或外源的過量蛋白酶為炎癥和感染條件下的組織提供保自、。。et2M還可以廣泛地結(jié)合多種細胞因子、細菌內(nèi)毒素、凝集素等分子，通過調(diào)節(jié)它們的活性參與廣泛的免疫防御和調(diào)節(jié)。c【2M與高等動物補體因子C3、C4、C5的結(jié)構(gòu)相似性提示其可能在溶血過程中行使某種功能。目前已經(jīng)在多種動物克隆了a2M基因，包括幾種節(jié)肢動物、線蟲等。貝類中也發(fā)現(xiàn)了Ⅱ2M活性并在少數(shù)種得到了純化蛋白，尚沒有基因
6、克隆的報道。根據(jù)a2M不破壞所抑制蛋白酶的活性位點這一特性，利用血漿保護試驗，首次證明了在稀孔扇貝和皺紋盤鮑(Hatiotisdiscushannai)中有a2M活性存在。在此工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)a2M序列同源性資料，利用簡并引物RT-PCR，PCRWalk以及5’RACE和3’RACE方法克隆了櫛孔扇貝Ⅱ2巨球蛋白eDNA全序列(檢索號：AY395573)。該基因全長6408bp其中編碼區(qū)5l57bp，5’端不翻譯區(qū)18bp，3’端不翻譯區(qū)1235bp(含polyA尾23bp)。ORF編碼1719個氨基酸，其
7、中前16個氨基酸殘基為信號肽序列，成熟蛋白質(zhì)分子量為192KDa，等電點為4．85。與來源于節(jié)肢動物鱟(Limuluspolyphemus)的a2M具有最高序列相似性。櫛孔扇貝a2M蛋白具有典型的a2M巨球蛋白的保守性結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示人C3、C4、C5與無脊椎動物a2M具有比脊椎動物ct2M更近的進化距離。三維結(jié)構(gòu)為：6段c【．螺旋構(gòu)成的內(nèi)層Ⅸ．螺旋桶和另6段c【．螺旋構(gòu)成的外層旺．螺旋桶形成a2M的結(jié)構(gòu)核心，少量的p．折疊片和大量D轉(zhuǎn)角位于分子表面。利用RT-PCR方法分析了櫛孔扇貝旺2巨球蛋白在
8、不同組織的表達情況。除血細胞外在其他檢測組織外套膜、閉殼肌、性腺、腸等均未檢出q2M表達。抑制消減雜交(SuppressionSubtractiveHybridization)是篩選差異表達基囚的有效方法。利用該方法篩選了櫛孔扇貝血細胞在感染脅迫條件下的差異表達基因。注射1×107酵母菌、大腸桿菌、溶壁微球菌的混合菌液脅迫櫛孔扇貝10小時后，分別抽墩處理組和對照組的【f口．細胞RNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA
