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1、熒光素酶報(bào)告基因檢測l????????原則熒光素酶檢測系統(tǒng)，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細(xì)胞中的熒光素酶，用其底物來檢測熒光素酶活性。檢測步驟如下：1)?????????加裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。2)?????????將上述裂解物轉(zhuǎn)移入微孔板或者試管中（根據(jù)檢測的需要選擇所用器材類型）。3)?????????加入含有所有酶反應(yīng)成分（必須包括底物熒光素），使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)開始。4)?????????用熒光儀或者液閃計(jì)數(shù)儀檢測所發(fā)射的熒光。?l????????特點(diǎn)u????????敏感度和檢測范圍：5fg熒光素酶u????????發(fā)射光的線性范圍：10fg—10
2、ngu????????確切的檢測限依檢測儀器而定。u????????特異性：本文介紹的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的操作步驟，通常用來檢測轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的活性。不適用于對(duì)細(xì)菌熒光素酶進(jìn)行檢測。?l????????器材和試劑u????????器材在微孔板或試管中，用自動(dòng)或手動(dòng)熒光儀、液閃計(jì)數(shù)儀或者攝影膠片都可以檢測到熒光素酶活性，而且高度敏感。當(dāng)用微孔板時(shí)可以是白色，也可為黑色。u????????試劑1)????????熒光素酶檢測試劑：熒光素酶檢測試劑包括熒光素、ATP、CoA、以及一些添加劑，這些試劑可以啟動(dòng)酶反應(yīng)。這種熒光酶檢測試劑
3、的混合物可穩(wěn)定保存在在-60℃以下12個(gè)月，-15℃~-25℃一個(gè)月，2℃~8℃只能保存一周。避免反復(fù)凍融。應(yīng)避光保存，因?yàn)闊晒馑卦诠庹障聲?huì)發(fā)生氧化。2)????????裂解緩沖液：下面將加以介紹。?l????????基本操作步驟下面的操作步驟適用于培養(yǎng)的真核細(xì)胞。提取物必須立刻檢測，否則必須在-15～-25℃儲(chǔ)存大約一個(gè)月。不要反復(fù)凍融以避免酶活性的降低。1)?????????將熒光素酶報(bào)告基因與b-gal對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行處理。2)?????????徹底吸去培養(yǎng)皿（60mm）中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，無鈣和鎂離子）小心沖洗
4、細(xì)胞3次，徹底去除剩余的PBS。10×PBS緩沖液：NaCl100g，KCl2.5g，Na2HPO414.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000ml。3)?????????加入最小體積的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液蓋過細(xì)胞，例如60mm的培養(yǎng)皿用360ml裂解液，35毫米的培養(yǎng)板用150ml裂解液。用橡皮刮將細(xì)胞刮離培養(yǎng)皿。將裂解物轉(zhuǎn)移到微量離心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液：1%（v/v）TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT（
5、臨用前加入）4)?????????在漩渦混合器上輕輕振蕩細(xì)胞裂解液，以最大速度4℃離心以去除細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量離心管中，置于冰上以備分析。5)?????????在開始化學(xué)發(fā)光反應(yīng)之前，將100ml的細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移到熒光儀或者液閃計(jì)數(shù)儀所用的檢測器皿中（我們建議用96孔板）。加入360ml熒光素酶分析緩沖液。熒光素酶分析緩沖液：25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，2mmol/LATP，1mmol/LDTT（臨用前加入）6)?????????用25mmol/L（pH7.8）的甘氨酰甘氨酸稀釋熒
6、光素至200mmol/L。熒光素貯液：1mmol/LD-熒光素（合成晶體蛋白，Sigma），25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），10mmol/LDTT。（分成1ml小份，-70℃保存在避光盒中幾個(gè)月）7)?????????樣品中加入200ml稀釋的熒光素液。熒光素在光照下迅速發(fā)生氧化，因此丟棄未用完的熒光素稀釋液。在562nm條件下進(jìn)行檢測。?l????????注意事項(xiàng)：1)?????????熒光素酶檢測試劑需在15-25℃的條件預(yù)平衡后再進(jìn)行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)檢測。當(dāng)用液閃計(jì)數(shù)儀時(shí)，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。.加入熒光素酶檢
7、測試劑0.5-10秒內(nèi)開始檢測發(fā)射光1-5秒，持續(xù)發(fā)光20秒后，產(chǎn)生光強(qiáng)度降低，其半衰期為5分鐘。2)?????????如果細(xì)胞裂解后不能立即對(duì)提取物進(jìn)行檢測，樣品可以在冰上保存大約5個(gè)小時(shí)，在-70℃可保存數(shù)月。3)?????????利用上述方法檢測冷的樣品時(shí)，其信號(hào)強(qiáng)度將下降5-15%。4)?????????在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號(hào)超出線性范圍（信號(hào)溢出），可用裂解液將樣品進(jìn)行稀釋。5)?????????我們建議不要儲(chǔ)存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為2.5mg/mL，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6)????????
8、?如果樣品中的熒光素酶的
