熒光素酶報告基因檢測原理

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1、為了適應公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務技能及個人素質的培訓計劃熒光素酶報告基因檢測原理　　熒光素酶報告基因檢測　　?原則　　熒光素酶檢測系統(tǒng)，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細胞中的熒光素酶，用其底物來檢測熒光素酶活性。檢測步驟如下：　　1)加裂解緩沖液裂解轉染的細胞。　　2)將上述裂解物轉移入微孔板或者試管中?！　?)加入含有所有酶反應成分，使化學發(fā)光反應開始?！　?)用熒光儀或者液閃計數(shù)儀檢測所發(fā)射的熒光?！　?特點　　?敏感度和檢測范圍：5fg熒光素酶　　?發(fā)射光

2、的線性范圍：10fg—10ng　　?確切的檢測限依檢測儀器而定。　　?特異性：本文介紹的熒光素酶報告基因系統(tǒng)的操作步驟，通常用來檢測轉染了螢火蟲熒光素酶　　基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性。不適用于對細菌熒光素酶進行檢測?！　?器材和試劑　　?器材目的-通過該培訓員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務技能及個人素質的培訓計劃　　在微孔板或試管中，用自動或手動熒

3、光儀、液閃計數(shù)儀或者攝影膠片都可以檢測到熒光素酶活性，而且高度敏感。當用微孔板時可以是白色，也可為黑色?！　?試劑　　1)熒光素酶檢測試劑：熒光素酶檢測試劑包括熒光素、ATP、CoA、以及一些添加劑，這些　　試劑可以啟動酶反應。這種熒光酶檢測試劑的混合物可穩(wěn)定保存在在-60℃以下12個月，-15℃~-25℃一個月，2℃~8℃只能保存一周。避免反復凍融。應避光保存，因為熒光素在光照下會發(fā)生氧化。　　2)裂解緩沖液：下面將加以介紹。　　?基本操作步驟　　下面的操作步驟適用于培養(yǎng)的真核細胞。提取物必須立刻檢測，否則必須在-1

4、5～-25℃儲存大約一個月。不要反復凍融以避免酶活性的降低?！　?)將熒光素酶報告基因與?-gal對細胞進行共轉染，按實驗計劃進行處理。　　2)徹底吸去培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液，用冰預冷的磷酸鹽緩沖液　　小心沖洗細胞3次，徹底去除剩余的PBS。10×PBS緩沖液：NaCl100g，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，用三蒸水定容至1000ml。目的-通過該培訓員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項目的正常、

5、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務技能及個人素質的培訓計劃　　3)加入最小體積的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液蓋過細胞，例如60mm的培養(yǎng)皿用360?l裂　　解液，35毫米的培養(yǎng)板用150?l裂解液。用橡皮刮將細胞刮離培養(yǎng)皿。將裂解物轉移到微量離心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液：1%TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT　　4)在漩渦混合器上輕輕振蕩細胞裂解液，以最大速度4℃離心以去除細胞碎片。將上清轉移到另　　一

6、個微量離心管中，置于冰上以備分析?！　?)在開始化學發(fā)光反應之前，將100?l的細胞提取物轉移到熒光儀或者液閃計數(shù)儀所用的檢測　　器皿中。加入360?l熒光素酶分析緩沖液。熒光素酶分析緩沖液：25m　　mol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，2mmol/LATP，1mmol/LDTT　　6)用25mmol/L的甘氨酰甘氨酸稀釋熒光素至200?mol/L。熒光素貯液：1mmol/LD-　　熒光素，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，10mmol/LDTT?！　?)樣品中加入200?l稀釋的熒

7、光素液。熒光素在光照下迅速發(fā)生氧化，因此丟棄未用完的熒光　　素稀釋液。在562nm條件下進行檢測?！　?注意事項：目的-通過該培訓員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務技能及個人素質的培訓計劃　　1)熒光素酶檢測試劑需在15-25℃的條件預平衡后再進行反應，而后依據(jù)具體條件進行自動或手　　動檢測。當用液閃計數(shù)儀時，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。.加入熒光素

8、酶檢測試劑秒內開始檢測發(fā)射光1-5秒，持續(xù)發(fā)光20秒后，產生光強度降低，其半衰期為5分鐘。2)如果細胞裂解后不能立即對提取物進行檢測，樣品可以在冰上保存大約5個小時，在-70℃可　　保存數(shù)月?！　?)利用上述方法檢測冷的樣品時，其信號強度將下降5-15%?！　?)在熒光素酶活性較高的情況下，導致信號超出線性范圍，可用裂解液將樣品進