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《志賀氏菌外排泵基因emre克隆表達及進化的分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、鄭碩士州大學(xué)位授予單位代碼：學(xué)號或申請?zhí)枺好芗墸?，警于論?045904301037論文題目：志賀氏菌外排泵基因emrE的克隆表達及進化分析作者姓名：張少平學(xué)科門類：理學(xué)專業(yè)名稱：細(xì)胞生物學(xué)導(dǎo)師姓名、職稱：吳健教授二oo七年五月摘要志賀氏菌屬(Shigella)細(xì)菌，是人類及靈長類動物細(xì)菌性痢疾(簡稱菌痢)00致病菌，是急性感染性腹瀉的主要病原體之一，主要流行于發(fā)展中國家，但發(fā)達國家也時有爆發(fā)。由于大量抗生素的不斷使用，導(dǎo)致志賀氏菌屬細(xì)菌的耐藥性逐年增加，使治療難度有增大的趨勢。主動外排機制在細(xì)菌多耐藥性產(chǎn)生機制中發(fā)揮著主要作用。目前研究已證實了志賀
2、氏菌中存在著多種耐藥外排泵蛋白。為了解志賀氏菌屬細(xì)菌的多重耐藥泵emrE的功能及其進化，本研究采用瓊脂二倍稀釋法測定抗生素對l臨床收集的志賀氏菌最低抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)這10株多耐藥志賀氏菌株的耐藥譜有一定差異，從中篩選出臨床多耐藥株H2,，并對其進行血清學(xué)鑒定，證實多耐藥株H24為宋內(nèi)氏志賀氏菌。利用PCR技術(shù)從宋內(nèi)氏志賀氏菌多耐藥株H24總DNA中克隆到包含自身啟動子的DNA片段。將該片段插入到原核克隆載體pMDl8-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50，對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，證實重組菌株構(gòu)建成功。對emrE基因進行測序，在此基礎(chǔ)上進行同源性比較并構(gòu)建進化樹。
3、測序結(jié)果表明該片段與Genbank中的宋內(nèi)氏志賀氏菌株S．sonneiSs046的emrE基因堿基序列完全一致，進化樹分析顯示emrE基因在不同細(xì)菌的基因組間無水平轉(zhuǎn)移的跡象。采用瓊脂二倍稀釋法檢測重組菌株在加入泵抑制劑氰氯苯腙(CCCP)前后對七種抗生素的最低抑菌濃度(MIC值1的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于未攜帶emrE的對照菌株pMD(DHSo)，重組菌株pMD-emrE(DH50)對四環(huán)素和紅霉素的MIC值分別提高了1倍和2倍，而對其它抗生素卻無明顯效果。加入泵抑制劑CCCP后重組菌株及對照株的耐藥程度則無明顯差異。證明eazrE介導(dǎo)的四環(huán)素和紅
4、霉素的耐藥與質(zhì)子外排泵相關(guān)。提取重組菌株及對照株的菌體總RNA，以大腸桿菌內(nèi)穩(wěn)定表達的看家基因gapA內(nèi)部的380bp片段作為內(nèi)參，gapA基因編碼大腸桿菌的甘油醛一3一磷酸脫氫酶，RT-PCR檢測主動外排基因emrE在重組株和對照株中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pMD—emrE(DI-ISo)重組菌emrE基因的表達水平比pMD(DH50)空白對照株有顯著提高。本研究結(jié)果表明：志賀氏菌多耐藥株emrE基因介導(dǎo)對四環(huán)素和紅霉素的抗性，這種能力可能與編碼區(qū)基因的突變無關(guān)，而與emrE基因編碼蛋白的表達量升高有關(guān)。通過對emrE基因的同源分析并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)菌
5、基因組間的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。關(guān)鍵詞t志賀氏菌：emrE基因；外排泵；耐藥：水平轉(zhuǎn)移；AbstractSh弛／／aisthemainpathogenofshigellosis．Itisanepidemiccontagionthroughouttheworld，especiallyinthedevolopingcountries．Sinceantimicrobialagentswerewidelyusedtotreatshignliosis，antimcrobialresistanceinShigellahasbeenwidelydispreaded．Now
6、increasingnumbersofShigellaexhibitresistancetomultipleantibacterials，whichconstitutesgreatdifficultytothepreventionandtreatmentofshigellnsis．Activeeffluxisamajormechanismofresistancetodragsinpathogenicmicroorganisms．Manyinvestigationshaverevealedthepresenceofeffluxtransportersi
7、nShigella．TostudythefunctionandevolutionoftheactiveeffiuxpumpgeneemrEinclinicalisolatesofShigella，antibioticssusceptibilityofthetenclinicalstrainsofShigellawastestedbythetwofoldagardilutiontechnique．Theresultsshowedthatthestrainswereresistanttomanykindsofantiobiotics．Finally，th
8、estrainH24wasselectedforitssignificantantiobioticresis
