福氏志賀菌ipaB基因的克隆及其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)

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1、!"卷"期微生物學(xué)報(bào)&’()!".’)"#$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!福氏志賀菌&.$/基因的克隆及其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)#00#0"姚瀟王恒!閆曉宇楊伯倫黃留玉（0軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所北京0$$$D0）（#陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西安D0$$%#）關(guān)鍵詞：福氏志賀菌，!"#$基因，表達(dá)中圖分類號(hào)：FD9%文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：G文章編號(hào)：$$$0:%#$1（#$$"）$":$!09:$!志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾為一

2、種全球性的腸道傳染病。據(jù)估計(jì)，全世界每年感染的人數(shù)超過(guò)兩［0］億，由該病引起的死亡人數(shù)有%3萬(wàn)左右。該菌的致病性是由體內(nèi)含有#"$HC的毒性大質(zhì)粒決定的，［#，"］而大質(zhì)粒上一個(gè)"0HC的片段所編碼的侵襲質(zhì)?？乖↖,J7K=’,L(7K<=M7,E=?-,，IL7）是致病所必需的。［!，3］近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者在原核生物中對(duì)!"#$基因克隆及功能進(jìn)行了較廣泛的研究，但在酵母細(xì)胞中這方面的研究未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。從志賀痢疾桿菌中克隆了!"#$基因，并在酵母細(xì)胞中得到了融合表達(dá)，為將IL7N應(yīng)用于雙雜交系統(tǒng)研究其在侵襲過(guò)程中的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。!材料和方法!"!菌株和質(zhì)

3、粒研究所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表0。表!菌株和質(zhì)粒菌株或質(zhì)粒遺傳型及性狀來(lái)源%O&’()*(+!#7#!3D4P=(ME@L-，.7(QR7+Q-((=G4,)-.’!S/3!T+L;!!，"(7BU0%1，>KMV0D，Q-BG0，-,MG0，?@QG1%，E>=W0，Q-(G0，.7(Q2INXY5NVZ%)-(+(/!0!#(G/0$1RG47，EQLW，(-+W，>=KW，GM-W，Z7B[WX(’,E-B>L2N4D2GZ!SNS，4V]0，B:R@BE7?，7,QX(’,E-B>L2N4:=L7NIL7N^+K-ME’2GZ!SNS，4V]0，B:R@

4、BE7?，7,Q4>=KP’QH!"#菌株培養(yǎng)痢疾桿菌#!3D4先在含$)$#3_剛果紅的4TG（4Q@LE=KB7K-K’@7?7Q）平皿上劃線培養(yǎng)，挑取紅色菌落接種于4TN（4Q@LE=KB7K-K’@CQ’E>）培養(yǎng)基在"D‘搖床培養(yǎng)。S/3!用ZN培養(yǎng)基培養(yǎng)、酵母菌G/0$1用a]GS培養(yǎng)基培養(yǎng)、G/0$1轉(zhuǎn)化后用TS5:4QL培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)?？股毓ぷ鳚舛龋嚎敲顾兀?,）3$#?5Z，萘啶酮酸（.7(）!$#?5Z。!"$工具酶及化學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶，4!S.G連接酶、1#2S.G聚合酶、]XV片段回收試劑盒為477V7公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提基金項(xiàng)目

5、：首都二四八重大創(chuàng)新工程（/$0$#0$"%$001）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（20111$3!0$"）"通訊作者。4-(5678：9%:0$:9"9#0$!!；;:<7=(：>+7,?(@A,=B)C<=)7B)B,作者簡(jiǎn)介：姚瀟（01%D:），男，陜西周至人，博士研究生，主要從事基因工程研究。;:<7=(：@7’8=7’3$A>’E<7=()B’<收稿日期：#$$#:$9:"$，修回日期：#$$#:00:01F期姚瀟等：福氏志賀菌’()*基因的克隆及其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)E:C取試劑盒為!"#$%&’公司產(chǎn)品。()*+(單克隆抗體、,!-和.-/)0"1

6、培養(yǎng)基購(gòu)自23#45%(6公司。!"#!"#$基因的擴(kuò)增取78!9培養(yǎng)過(guò)夜的痢疾桿菌，離心棄上清后加等體積去離子水，沸水煮:8$;4后離心，取菌裂解液的上清7$$#3/9的?@0!A!9，:8B!2=緩沖液:8!9，<8!$#3/9的引物!:、!<各:!9，補(bǔ)水至:88!9。反應(yīng)條件為：C7DE$;4后，按下列參數(shù)循環(huán)F8次，C7D變性F8G，7

7、MD連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌-N7"，提取重組質(zhì)粒酶切鑒定。!"%序列測(cè)定取酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，由上海博亞生物工程有限公司完成。!"&酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)［M］用醋酸鋰法將1JKL0);1’K轉(zhuǎn)化酵母ON:8C細(xì)胞，鋪.-/)0"1平板篩選。!"’酵母蛋白的提取挑取<$$PF$$大小的菌落過(guò)夜培養(yǎng)后，按23#45%(6公司提供的操作說(shuō)明，用尿素/.-.法提取酵母蛋白質(zhì)。!"()*)+,-./和01231456783395:分析按文獻(xiàn)［H］對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行.-.)!OJQ和R%G5%"4S3#55;4&分析。由于1JKL0H質(zhì)粒在表達(dá)與JO9E的融

8、合蛋白中含有()*+(標(biāo)